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桔小实蝇是世界上最重要的果蔬害虫之一,卵产于果实内,孵化后的幼虫在果实内取食为害。桔小实蝇一生历经多次蜕皮和两次变态发育（幼虫到蛹和蛹到成虫）,这些进程伴随着一系列复杂的形态变化和生理生化反应,新表皮鞣化反应是其中一个关键环节。桔小实蝇化蛹过程中新生成的白色柔软蛹壳会在较短时间内完成鞣化反应（骨化和着色）,以保护虫体和快速适应外界多变的生存环境。鉴定和挖掘害虫特定发育阶段的功能基因,对于研发环境友好型的生长调节剂有重要指导价值。本学位论文以桔小实蝇为研究对象,聚焦幼虫变态发育过程的蛹壳鞣化反应,鉴定化蛹进程中的关键通路基因,并深入分析重要基因的生理功能。主要研究结果如下:1桔小实蝇蛹壳鞣化关键通路基因的鉴定及其表达模式分析采用高通量测序技术对处于化蛹关键时间节点的桔小实蝇进行表达谱测序,共获得74.62 GB干净数据,各样本与桔小实蝇基因组数据的匹配率为70.09%-74.44%,平均GC含量和Q30分别为41.54%和91.61%。进一步分析转录组数据得到11,721条基因序列,其中11,301个基因能够在桔小实蝇基因组中得到注释,约占基因总数的83.76%,420个未能在基因组中得到注释的基因可能为新基因。分析这些基因的表达模式,发现有许多基因在化蛹过程中差异表达,GO、COG和KEGG通路分析显示氧化磷酸化通路、解毒代谢通路（P450）、保幼激素合成与代谢及信号传导和转运通路、蜕皮激素合成和信号通路、几丁质合成与代谢等通路均显著富集,表明它们可能在化蛹过程中发挥重要功能。另外,与昆虫表皮鞣化相关的酪氨酸代谢通路和表皮蛋白基因均在化蛹过程中变化显著,暗示它们在桔小实蝇蛹壳鞣化反应中具有重要作用。基于桔小实蝇基因组数据对酪氨酸代谢通路基因进行注释,共鉴定出24个关键基因。基于课题组已有的桔小实蝇各发育阶段（卵期、1龄幼虫早期、1龄幼虫晚期、2龄幼虫早期、2龄幼虫晚期、3龄幼虫早期、幼虫漫游期、幼虫漫游晚期、白蛹期、6 h蛹壳、12 h蛹壳、3 d蛹、5 d蛹、蛹晚期和刚羽化成虫）的转录组数据,分析上述24个基因的表达模式。结果显示酪氨酸羟化酶（BdTH）、多巴脱羧酶（BdDDC）、BdEbony、天冬氨酸脱羧酶（BdADC）、BdTan、BdMCO4、Bdyellow-c、Bdyellow-f和Bdyellow-f2基因均在蛹壳鞣化的关键时期高表达,同时结合昆虫体壁醌鞣化理论成功推导出桔小实蝇蛹壳鞣化反应的通路图:BdTH酶催化酪氨酸形成多巴（Dopa）,大部分Dopa被BdDDC酶催化生成多巴胺（Dopamine）;一部分Dopamine被BdMCO4、Yellow、Yellow-e和Yellow-h酶催化形成多巴胺色素（深棕色或者黑色）,还有一部分Dopamine在BdEbony、BdADC和BdTan酶的相互配合催化下生成NBAD;接着被BdMCO4酶催化生成NBAD-醌,同时与表皮蛋白相互交联形成鞣化蛋白进而完成蛹壳骨化;而蛹壳着色反应由NBAD-pigment（黄色或者红棕色）和Dopamine色素共同完成。进一步分析显示,桔小实蝇蛹壳和成虫体壁的鞣化反应通路存在差异,羽化过程中的鞣化反应主要依靠NADA-醌来完成。2桔小实蝇酪氨酸羟化酶基因在蛹壳鞣化过程中的功能研究以桔小实蝇蛹壳鞣化反应通路关键的BdTH酶基因（蛹壳鞣化通路的起始反应酶和限速酶）为研究对象,利用巢式PCR技术在桔小实蝇老熟幼虫表皮组织中克隆获得BdTH的cDNA序列,完整开放阅读框1737 bp,编码578个氨基酸残基,预测编码蛋白的分子量65.3 kDa,理论等电点（pI）5.44。多重序列比对发现,BdTH在N-末端不存在信号肽,但是拥有保守的酸性区域（PI=3.78）、丝氨酸位点（ser32）和C末端。系统发育分析结果显示,BdTH序列与实蝇类昆虫TH亲缘关系较近,同时双翅目昆虫TH蛋白单独聚为一支。采用定量qPCR和半定量RT-PCR技术分析BdTH的时空表达模式,结果显示BdTH在老熟幼虫表皮（EP）和中枢神经系统（CNS）组织中高表达,且在幼虫向蛹期转变过程中表达量显著升高,暗示BdTH在蛹壳鞣化（骨化和着色）反应中具有重要功能。对桔小实蝇5日龄幼虫注射dsBdTH后,BdTH的mRNA表达量减少50-60%,试虫羽化率下降到63%（对照组为94%）。相应地对幼虫注射或饲喂不同浓度的TH酶抑制剂（3-IT）后,试虫羽化率随着抑制剂浓度增加而显著降低。饲喂高浓度TH抑制剂3-IT（10 mg/g）后,桔小实蝇幼虫都能顺利化蛹,但蛹壳颜色变浅（着色不完全）,且蛹壳柔软（骨化不完全）,蛹重显著降低。扫描电镜结果显示,抑制剂处理后的蛹壳表面呈现异常表型,清晰的横纹消失。而且饲喂抑制剂导致试虫体内多巴胺含量显著降低,下游基因BdDDC和BdEbony表达量显著上调,表明蛹壳鞣化通路存在反馈机制。上述结果证明BdTH对于桔小实蝇蛹壳鞣化反应至关重要,伴随BdTH基因表达量下调和酶活被抑制,造成多巴胺合成路径受阻,进而对蛹壳鞣化反应造成影响。此外,饲喂抑制剂3-IT导致老熟幼虫体内黑色素产生量显著减少,4个抗菌肽基因（Bddefensin,Bdattacin,Bdcecropin-A和Bdcecropin-B）的表达量显著下降,且对大肠杆菌的抵抗能力显著降低。以上结果说明BdTH不仅参与桔小实蝇蛹壳的鞣化反应,还参与幼虫化蛹过程中的免疫反应。3桔小实蝇多巴脱羧酶基因在蛹壳鞣化过程中的功能研究采用巢式PCR技术,在桔小实蝇老熟幼虫表皮中克隆获得BdDDC的cDNA序列,完整开放阅读框1428 bp,编码475个氨基酸残基,预测蛋白的分子量和理论等电点（pI）分别为53.3 kDa和6.29。多重序列比对显示桔小实蝇DDC氨基酸序列分别与黑腹果蝇（82.53%）、家蚕（72%）和赤拟谷盗（74.53%）有较高的相似性。BdDDC序列在N-端含有糖基化位点、吡哆醛-5-磷酸结合位点和一段富含甘氨酸区域。系统发育关系分析结果显示双翅目昆虫DDC蛋白单独聚为一支。采用qPCR和半定量RT-PCR技术对BdDDC基因的时空表达模式进行分析,结果显示BdDDC主要在老熟幼虫表皮和中枢神经系统高表达,且该基因的表达量在桔小实蝇蛹壳鞣化（蛹壳着色和变硬）的关键时期显著升高。进一步从蛋白水平检测不同发育阶段BdDDC酶的活性变化,结果与BdDDC基因的表达模式一致,据此推测BdDDC在桔小实蝇化蛹及蛹壳鞣化反应中具有重要功能。使用多巴脱羧酶抑制剂（L-α-M-D）饲喂桔小实蝇5日龄幼虫,结果显示高浓度抑制剂（20 mg/g）处理导致试虫BdDDC酶活性显著下降,参与表皮着色的4个关键基因（BdMCO4、Bdyellow-c、Bdyellow-f和Bdyellow-f2）的表达量均有一定程度的升高,试虫体内多巴胺含量显著降低,化蛹时间推迟,出现大量黑化蛹,蛹重和羽化率显著降低。扫描电镜观察结果显示,饲喂高浓度BdDDC抑制剂（20 mg/g）导致试虫蛹壳表面横纹消失,且呈现不规则形态;冷冻切片结果发现蛹壳厚度显著降低。上述结果证实BdDDC酶基因对于桔小实蝇蛹壳鞣化反应至关重要。4桔小实蝇CPs基因鉴定及CPAP3家族基因在蛹壳形成过程中的功能研究4.1桔小实蝇CPs基因全基因组鉴定及其表达模式分析基于桔小实蝇基因组（NCBI Assembly:ASM78921v2）,通过同源序列比对共鉴定出164个CPs基因,分属于9个家族,包括:97个CPR、25个Tweedle、10个CPAP1、8个CPAP3、9个CPLCA、4个CPLCG、5个CPLCP、1个CPCFC和5个CPF家族基因。序列分析发现,桔小实蝇各个表皮蛋白家族基因均有其特定的保守序列。CPR家族包含R&R基序;Tweedle蛋白拥有4个保守氨基酸区域,区域I包含1个KX2Y/F基序,区域II有1个KX4-5FIKAP序列,区域III包含1个TX2YVL基序,区域IV则包含KPEVYXFV/IKY序列;CPAP1和CPAP3蛋白分别有1个和3个几丁质结合域（ChtBD2）;CPLCA蛋白包含保守的retinin结构域;CPLCG蛋白序列包含35个氨基酸保守基序,且在这35个序列第9-20位上存在1个标签基序G-X2-H-X-A-P-X2-G-H;CPLCP家族蛋白序列中拥有高密度脯氨酸PV和PY重复序列;CPF家族拥有44个氨基酸残基保守序列;CPCFC蛋白序列包含3个重复的16个氨基酸保守区域,且每个拷贝均以C-X5-C基序结尾。选取黑腹果蝇（模式昆虫）、地中海实蝇（与桔小实蝇亲缘关系较近）以及鳞翅目、膜翅目和鞘翅目昆虫的CPs进行系统发育分析。结果得出双翅目昆虫所特有的CPs基因簇和表皮发展模式;一些CPs基因在不同种类昆虫间独立进化,另一些则主要基于特定保守结构域进化。不同组织的表达模式分析显示多数CPs基因在桔小实蝇外周表皮中有表达;内部器官如脂肪体、肠道、卵巢和精巢等组织中也检测到相应CPs基因的表达,表明表皮蛋白家族基因功能的重要性和多样性。桔小实蝇CPAP3家族基因序列不仅在昆虫间非常保守,而且相较于其它CPs基因,其几乎所有家族成员均在老熟幼虫（化蛹前期）表皮中显著高表达,暗示它们可能参与桔小实蝇蛹壳的形成过程。4.2桔小实蝇CPAP3家族基因在蛹壳形成过程中的功能研究桔小实蝇CPAP3家族蛋白拥有3个保守几丁质结合域,暗示拥有潜在几丁质结合能力。选取CPAP3-D2和E蛋白,通过原核表达技术获得重组蛋白,将纯化获得的蛋白与几丁质树脂进行孵育,二者与几丁质的结合效率分别为66.72%和52.78%,高于对照牛血清蛋白（18.06%）。CPAP3家族基因的时空表达模式显示,CPAP3-A1、B、E和E2基因不仅在桔小实蝇老熟幼虫表皮组织中高表达,而且它们的表达量均在幼虫化蛹关键时期显著上调;保幼激素类似物处理试虫导致4个基因的表达量被显著抑制,而蜕皮激素20E处理后这4个基因的表达均被显著诱导。以上结果说明CPAP3家族基因可能在小实蝇化蛹过程中发挥作用。使用RNA干扰技术,对桔小实蝇5日龄幼虫分别注射CPAP3-A,B,E and E2基因的dsRNA,沉默效率在35%-60%之间,结果导致幼虫发育显著延迟,化蛹时间显著延长。特别是RNA干扰降低BdCPAP-E基因的表达量后,造成40%的幼虫死亡（躯体变得僵硬和紧绷,缺乏应有的松弛性）。CPAP3-D2在卵期的表达量显著高于其它任何一个发育阶段,免疫组化分析结果显示CPAP3-D2是桔小实蝇卵壳重要的结构蛋白。定量结果显示CPAP3-D2基因表达水平在桔小实蝇卵巢发育成熟过程中显著升高,RNA干扰沉默该基因导致卵巢发育和卵巢管形成受到显著抑制。上述结果明确了桔小实蝇表皮蛋白家族基因不仅参与蛹壳形成,而且对于昆虫的生殖发育亦至关重要。综上所述,本学位论文聚焦桔小实蝇幼虫化蛹这一关键时期,在完成该发育阶段表达谱数据库构建,推导出蛹壳鞣化反应通路图的基础上,分别靶向蛹壳鞣化通路的关键基因BdTH、BdDDC和CPAP3,并进行深入的功能探究,挖掘它们在桔小实蝇蛹壳鞣化反应中的重要功能。研究结果不仅加深了对桔小实蝇鞣化反应的认识,同时筛选出的一些关键功能基因有可能成为害虫防治新的作用靶点。