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第一部分基于iTRAQ定量蛋白组学技术对HBV相关性肝癌血浆差异蛋白的鉴定及筛选目的：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在各种恶性肿瘤中排第六位。在中国HCC高居恶性肿瘤病死率的第二位，慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是导致HCC最主要的病因之一。目前，乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌（HBV-related HCC）的发病机制尚不完全清楚。本研究拟对与HBV相关性肝细胞癌相关的蛋白质进行鉴定及验证。方法：随机选取HBV相关性肝细胞癌、肝硬化（liver cirrhosis）、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）及健康对照人群四组患者的血浆样本，每组15例，分别混合后利用基于iTRAQ联合液相色谱与串联质谱分析的定量蛋白质组学技术，对四组人群血浆蛋白质组进行比较研究，并鉴定出差异表达蛋白质。进一步用实时定量PCR、免疫印迹及免疫组织化学检测等对部分差异蛋白的表达水平加以验证。结果：通过对HBV相关性肝细胞癌与非癌性对照人群混合血浆样品的质谱分析，我们共发现452种非拓余蛋白质，并从中成功鉴定出各队列之间差异表达蛋白21种。这21种差异蛋白涉及到17种蛋白质结构类型、7种分子功能类型，参与人体13种重要的生物学过程。基于文献检索和课题组研究方向，我们从21种差异表达蛋白中选择其中4种，即vWF、SAA、APOE及ALDOB，对随机选取的四组队列患者血浆和癌及癌旁组织样本，分别用免疫印迹、实时定量PCR和免疫组化染色检测对其表达水平进行验证。结果显示4种蛋白表达水平的差异与质谱分析结果一致。进一步研究发现，HBV相关性肝癌患者血浆vWF表达量高于非癌性对照病例；癌组织中vWF mRNA及蛋白表达水平亦明显高于癌旁肝组织。结论：通过iTRAQ定量蛋白质组学技术，我们从HBV相关性肝细胞癌与非癌性对照人群血浆样品中成功鉴定出一批差异表达蛋白，并对其中部分差异蛋白进行了验证。作为质谱分析筛选出来的差异蛋白之一，vWF在肝癌患者血浆及癌组织中的表达水平明显增高，提示vWF可能与HBV相关性肝癌的发病相关。第二部分vWF对肝癌细胞生物学行为和HBV复制的影响及机制研究目的：前一部分研究我们发现，vWF在HBV相关性肝癌患者血浆及癌组织中的表达水平明显增高，提示vWF可能与肝癌的发生、发展相关。在本部分研究中，我们主要探究vWF对肝癌细胞株生物学行为以及HBV复制的影响及其作用机制。方法：我们采用siRNA转染技术下调HCC细胞株vWF的表达水平。转染48小时后用免疫印迹法验证敲出效果。转染成功后，采用划痕实验、Matrigel侵袭实验评估下调vWF表达后肝癌细胞株体外迁移与侵袭能力。流式细胞学检测细胞周期与细胞凋亡的变化。MTS法检测细胞增殖能力。采用免疫印迹法检测肝癌细胞株STAT3, pSTAT3,MMP2, MMP9, integrin αvβ3and Gal-1的表达水平。ELISA和实时定量PCR法定量检测转染vWF-siRNA的HepG2.2.15细胞培养基上清中HBsAg、HBeAg和HBV DNA浓度，以及细胞内I型干扰素及其下游干扰素激活基因的mRNA转录水平。结果：成功转染vWF siRNA后，伴随vWF表达减少，肝癌细胞株的体外迁移与侵袭能力明显受损；细胞发生G2/M期阻滞，凋亡比例增加，增殖能力降低。同时，细胞STAT3、pSTAT3、MMP2、MMP9表达水平有不同程度的降低；细胞表面整合素αvβ3表达与功能异常；细胞表达Gal-1亦明显下降。此外，转染vWF siRNA后，HepG2.2.15细胞分泌HBV DNA、HBsAg及HBeAg的滴度降低，并伴随有I型IFN及部分下游干扰素诱导基因（ISG15，OAS1，OAS2，RNase L和EIF-2α）mRNA表达水平增高。结论：vWF可能是HBV感染及其相关性肝癌发病机制中的关键分子之一，通过影响STAT3通路活化及其下游MMP2、MMP9表达，引起肝癌细胞整合素αvβ3、Gal-1等生物活性分子的表达和/或功能异常，干扰I型IFN抗病毒信号通路转导等，多种途径影响肝癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭，以及HBV复制。第三部分vWF与HBV相关性肝癌诊断及临床病理分期的相关性研究目的：我们先前的研究表明vWF在HBV相关性肝癌患者血浆及癌组织中的表达量明显增高。本部分研究旨在评估vWF表达水平与HBV相关性肝癌诊断及临床病理分期的相关性。方法：采用ELISA试剂盒定量检测HBV相关性肝癌、肝硬化、慢性乙型肝炎和健康对照四组患者血浆vWF浓度。用免疫组织化学法检测vWF在肝癌组织中的表达水平，并用一半定量评分系统进行量化评分。用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析评价vWF对肝癌的预测能力。Spearman秩相关分析检验vWF表达水平与肝癌临床病理分期之间的相关性。结果：HBV相关性肝癌、肝硬化、慢性乙型肝炎和健康对照组患者平均血浆vWF浓度分别为2322±1089mU/mL、1760±1217mU/mL、866±417mU/mL和317±66mU/mL；各组间两两比较具有统计学差异。ROC分析表明血浆vWF对HCC的预测效能要高于AFP，其曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）为0.830，以1100mU/mL为临界值，灵敏度为91.8%，特异性为71.0%，较之AFP的0.719，70.2%，62.5%有明显提高。此外，vWF在血浆及肝癌组织中的表达水平与肝癌患者TNM分期之间存在一定相关性，其相关系数分别达到0.821（P <0.05）和0.691（P <0.05）。结论：初步研究表明，vWF可能是一个非常有潜力的HBV相关性肝细胞癌诊断与病情监测的血浆标记物。其临床应用价值，还有待我们进一步扩大病例规模，通过多中心前瞻性随机对照试验加以验证。