论文部分内容阅读
目的：观察丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及其亚族细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated protein kinase ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)/应激激活蛋白激酶(SAPK)、p38在雌激素刺激内皮祖细胞(EPCs)迁移和增值中的作用。方法：(1)单个核细胞的分离:用50U/ml肝素2ml润湿空针后抽取脐带血约50ml,加入3％明胶16ml(脐带血:明胶=3:1)沉淀后加入人淋巴细胞分离液用密度梯度离心法分离出单个核细胞,活力计算活性达98％可以接种。(2)诱导分化:成纤维细胞多于24小时内贴壁,因此培养24小时后取未贴壁细胞以4×106/cm2接种于包被有纤维连接蛋白的24孔培养板(每孔lml),每孔中加入M199培养液lml,添加10％胎牛血清、1％青链霉素(1万单位/ml)、 VEGF(50ng/ml),置于5％CO2、饱和湿度37℃孵育箱中培养,换培养液培养至7d,贴壁细胞供实验用。(3)EPCs鉴定:培养细胞爬片后,然后分别加入鼠抗人 CD133单克隆抗体(1:100稀释)、DiI-ac-LD、FITC-UEA-1分别在倒置相差显微镜及免疫荧光显微镜下观察拍照。(4)实验分组:本实验共分五组,分别为对照组:正常培养EPCs未加入任何药物;雌二醇(E2)组:EPCs培养7天后加入 E2;PD98,059(ERK抑制剂)组:培养7天后先用PD98,059作用细胞24h再加入E2;SP600125(JNK抑制剂)组:培养7天后先用SP600125作用细胞24h再加入 E2;SB203580(p38抑制剂)组:培养7天后先用SB203580作用细胞24h再加入E2。(5)观测指标:①酶联免疫检测仪检测各组活细胞数(结果以吸光值表示)。②选取特定浓度用流式细胞检测仪分析各组细胞周期变化。③将细胞悬液种在Traswell小室上层,下层加入趋化因素,观察由上层小室迁入下层小室的细胞数。结果：(1)单个核细胞分离:从脐带血中分离的单个核细胞在显微镜下呈圆形、透亮,台盼蓝染色显示存活率>95％。(2)EPCs鉴定:取培养第7天的细胞做免疫荧光检测CD133呈绿色,阳性率达95％以上。取培养第9天的细胞检测内皮细胞特异性抗体 Dil-ac-LDL呈红色,FITC-UAE-1呈绿色,Dil-ac-LDL和FITC-UAE-1双染的细胞为 EPCs呈现黄色。染色结果显示黄色细胞>90％。(3)酶联免疫检测活细胞数实验结果:对照组的吸光值为0.4163±0.0503,E2组吸光值为0.6940±0.0143,与对照组相比有显著意义(P<0.05),说明E2可以引起EPCs增值;PD98,059在5umol/L、10umol/L、20umol/L、40umol/L、80umol/L吸光值分别为0.7406±0.0376、0.6177±0.1043、0.5211±0.0793、0.5032±0.0975、0.4522±0.0406,与E2组比较PD98,059在20umol/L、40umol/L、80umol/L时有统计学意义(P<0.05),表明PD98,059可以阻断 E2引起的EPCs增值;SP600125在1umol/L、25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L吸光值分别为0.6152±0.0406、0.4255±0.0395、0.3882±0.0185、0.4090±0.0761、0.4168±0.1012,与E2组相比SP600125在25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L时有统计学意义(P<0.05),表明SP600125可以阻断E2引起的EPCs增值; SB203580在5umol/L、10umol/L、15umol/L、20umol/L、25umol/L吸光值分别为0.6670±0.6223、0.6350±0.8311、0.6312±0.6437、0.6285±0.6462、0.6500±0.6036,与 E2组相比所有浓度均没有统计学意义(P>0.05)。(4)流式细胞仪检测细胞周期:E2组S期所占比例为(33.15±0.212)％与对照组(11.55±0.212)％相比有统计学意义(P<0.05),表明 E2可以刺激EPCs增值;PD98,059组S期比例(16.25±6.434)％与E2组相比有统计学意义(P<0.05),表明其可以阻断 E2引起的EPCs增值;SP600125组 S期比例(12.55±1.202)％与 E2组相比有统计学意义(P<0.05),表明其可以阻断 E2引起的EPCs增值;而SB203580组S期所占比例为(24.80±6.223)％与E2相比没有统计学意义(P>0.05),表明其不能减弱E2生物学效应。另外E2组G1期细胞比例为(34.45±0.495)％与对照组(62.90±4.384)％相比P<0.05有统计学意义, PD98,059组G1期细胞比例为(57.40±7.640)％与E2组相比P<0.05有统计学意义,SP600125组G1期细胞比例为(53.95±1.344)％与E2组相比P<0.05有统计学意义,SB203580组(44.75±1.630)％与E2组相比P>0.05没有统计学意义,上述结果与各组S期比较结果一致。(5)Traswell迁移实验:对照组下层细胞数为22.80±8.643;E2在浓度为1×10-8 mol/L时下层细胞数为65.20±12.617,与对照组比较有显著性增加(P<0.05),表明 E2可以促进 EPCs的迁移能力;PD98,059在5umol/L、10umol/L、20umol/L、40umol/L、80umol/L浓度时下层细胞数分别为54.00±11.576、42.40±7.057、42.00±7.416、29.40±5.640、22.80±5.263,与 E2组相比 PD98,059在20umol/L、40umol/L、80umol/L浓度时有统计学意义(P<0.05),表明PD98,059可以阻断 E2的促迁移能力;SP600125在1umol/L、25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L浓度时下层细胞数分别为56.00±12.390、44.00±9.027、50.40±14.484、51.80±17.513、68.40±5.320,与E2组相比SP600125在25umol/L、50umol/L、75umol/L时有统计学意义(P<0.05),表明 SP600125也可以阻断 E2的促迁移能力;SB203580在5umol/L、10umol/L、15umol/L、20umol/L、25umol/L浓度时下层细胞数分别为62.40±7.830、59.40±11.330、55.80±7.050、61.20±9.038、60.40±7.128,与E2组相比所有浓度均没有统计学意义(P>0.05)。结论：(1)雌激素可以促进内皮祖细胞的增值和迁移。(2)雌激素促进内皮祖细胞的增值和迁移可能与ERK、JNK亚通路有关,阻断这两条通路可抑制此种作用;在正常细胞模型中阻断p38通路不能减弱雌激素促进内皮祖细胞增值和迁移的作用。