论文部分内容阅读
文昌鱼是现存的与脊椎动物原始祖先最接近的头索动物，一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的模式动物。文昌鱼的基因序列和表达模式已经被广泛用于不同物种之间的比较基因组学研究和发育同源性分析。本文从青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtaune )肠cDNA文库中，克隆了具有完整编码框的磷脂酰胆碱转运蛋白(AmphiPCTP)、室管膜相关蛋白(AmphiERP)和gamma-氨基丁酸A型受体相关蛋白(AmphiGABARAP)基因，并对其结构、进化和表达进行了研究。
首先，从青岛文昌鱼消化道cDNA文库中克隆到全长为1457bp的AmphiPCTPcDNA，最大开放阅读框编码219个氨基酸的蛋白质，理论分子量为25.58 kDa，该cDNA编码的蛋白包含一个完整的START结构域。AmphiPCTP和哺乳动物、鸟类和鱼类的PCTP序列同源性几乎相等(50-55％)，没有明显差异；通过构建的START蛋白家族系统进化树分析可知，AmphiPCTP和PCTP亚家族的PCTP亚组成员聚集在～起，并介于脊椎动物和无脊椎动物之间，这与文昌鱼是脊椎动物和无脊椎动物之间的过渡类型的观点相一致。上述分析表明，AmphiPCTP可能代表了脊椎动物PCTP的原型，且约5.5亿年前脊椎动物和无脊椎动物从共同祖先分化以后，包括人在内的脊椎动物PCTP变异不大。和哺乳动物PCTP相比，AmphiPCTP和磷脂酰胆碱作用的氨基酸残基以及PKC磷酸化位点非常保守，AmphiPCTP行使的功能可能类似于哺乳动物的PCTP，这也得到文昌鱼PCTP与哺乳动物PCTP基因组具有相似的外显子一内含子结构这一事实的支持。Northern结果显示，AmphiPCTP的转录产物为一条带，大小为1450bp。切片原位杂交分析表明，AmphiPCTP在成体组织中呈组织特异性表达，在肝盲囊和卵巢表达量最高，而人和鼠PCTP在肝脏表达量最高，从而支持了文昌鱼肝盲囊和脊椎动物肝脏同源这一观点。胚胎整体原位杂交结果表明，AmphiPCTP从两天幼虫开始到十天的幼虫持续在中肠附近表达，而这个部位恰恰是以后发育为肝盲囊的部位，这正好和AmphiPCTP在成体文昌鱼肝盲囊表达量最高相符合，并且小鼠胚胎及幼体发育过程中PCTP主要是在肝脏中表达，这又一次支持了文昌鱼肝盲囊和脊椎动物肝脏同源的说法。切片原位杂交以及整体原位杂交结果也提示我们，文昌鱼PCTP和哺乳动物PCTP功能保守，即可能在体内行使着相似的功能。
第二个从青岛文昌鱼消化道cDNA文库中克隆到的基因是ependymin-relatedprotein基因，即AmphiERP。该cDNA全长1004bp，编码一个203个氨基酸的蛋白质，理论分子量22.59 KDa。该蛋白含有一个ependymin结构域，含有ependymin的典型特征：四个保守的半胱氨酸。该基因编码的蛋白在N．端有一个18个氨基酸的信号肽，序列含有三个N-连接的糖基化位点，表明AmphiERP可能和其他物种的ependymin一样为分泌型糖蛋白。氨基酸序列比较和构建的系统进化树说明AmphiERP在进化关系上与脊椎动物的ependymin更为接近。Northern blot和切片原位杂交结果显示，AmphiERPmRNA在成体文昌鱼组织中呈组织特异性表达，在后肠和肝盲囊表达最强，提示该基因可能和消化道的某些功能相关。胚胎整体原位杂交结果表明，AmphiERP基因从文昌鱼受精卵到一天幼虫各发育时期均不表达，发育到两天幼虫时开始在原始消化道中有转录，从两天到十天的幼虫，AmphiERP基因均在原始消化道的中间三分之一处有转录，提示AmphiERP在文昌鱼发育过程中可能与消化道的发育以及功能相关。对AmphiERP的功能进行分析，发现细菌外毒素LPS处理文昌鱼后AmphiERP基因表达水平迅速升高，随着时间延长表达水平呈现逐渐恢复的趋势，AmphiERP对LPS起急性炎症应急反应，该基因可能还和免疫相关。低温胁迫处理文昌鱼以后AmphiERP基因表达量与对照相比没有明显变化，提示AmptliERF基因对于文昌鱼适应低温条件并没有显著作用。
第三个从青岛文昌鱼肠cDNA文库中克隆到的基因是AmphiGABARAP基因。该cDNA克隆全长1246bp，最大开放阅读框为354bp，编码117个氨基酸组成的蛋白，理论分子量为13.9kDa。系统进化树分析表明，AmphiGABARAP与其他物种的GABARAP聚集在一起，而与GABARAP—like(GABARAPL)分开，并且与文昌鱼的GABARAPL2相分离。通过与脊椎动物和无脊椎动物的GABARAP序列比较发现，GABARAP在进化过程中高度保守，AmphiGABARAP序列N-端和哺乳动物一样具有保守的微管蛋白结合区以及GABA<,A>受体结合位点，表明，AmphiGABARAP可能和哺乳动物的GABARAP具有相似的功能。文昌鱼GABARAP的基因组结构和人、小鼠、斑马鱼以及海鞘GABARAP同源物在外显子数目和每个外显子序列上非常保守，提示，GABARAP在所有的脊索动物中的转录调节非常相似。整体原位杂交结果显示，文昌鱼GABARAP基因在成体组织中和哺乳动物表达模式一样，为广泛性表达模式，而在胚胎发育过程中表现为时间和空间特异性表达模式，只在2天和10天幼虫原始消化道的中间部位表达，表明GABARAP在文昌鱼和哺乳动物中具有保守的功能。