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人肝细胞癌是位于世界第三位导致患者死亡的恶性肿瘤,是严重危害人类健康的重大疾病。手术是最为有效而确切的治疗手段,但由于肝癌起病隐匿且恶性程度高,大部分患者发现时即已属晚期,丧失手术机会,故化疗仍然是晚期肝癌治疗的重要手段,但肝癌的多药耐药性的发生常导致治疗失败。目前研究表明,肝细胞癌等恶性肿瘤常高表达Bcl-2蛋白家族内Bcl-2、Bcl-XL等抗凋亡蛋白,通过调节抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白间的平衡,使肿瘤发生凋亡逃逸。因此抑制Bcl-2的过表达将成为一种有效的肿瘤治疗方法。目前开发出的ABT-737是一种BH3蛋白模拟物,能够特异性地抑制Bcl-2/Bcl-XL等在BH3结构域与Bax/Bak的结合,从而诱导凋亡。诸多学者认为自噬可以在肿瘤形成的初始阶段起到抑制作用,但后期肿瘤细胞往往可通过自噬应答降低化疗药物的杀伤作用。研究表明,自噬通过降解受损的细胞器及细胞内老化蛋白质等,促进细胞修复和生存,在治疗中常使肿瘤细胞免受凋亡和坏死,成为肿瘤耐药的重要的机制之一。目前临床上亦采用Bcl-2抑制剂ABT-737进行肝细胞癌治疗的研究,但由于ABT-737可以通过某些因素诱导自噬,常导致耐药的发生,成为肝癌治疗研究中的重要瓶颈。因此,本研究以人肝细胞癌细胞株Hep G-2及阿霉素耐药细胞株Hep G-2/ADM为研究对象,探讨Bcl-2抑制剂ABT-737诱导的自噬在其诱导的阿霉素耐药细胞株Hep G-2/ADM凋亡中的作用及机制,更好地理解其在肝癌治疗中的耐药机制,探寻潜在的药物作用靶点,开发新的治疗模式,对提高肝癌患者生存质量、延长生存期具有重要意义。方法(1)Westernblot方法检测人肝癌细胞株Hep G-2和人肝癌阿霉素耐药细胞株Hep G-2/ADM中Bcl-2及Bax蛋白的表达差异;(2)MTT法检测不同剂量ABT-737及不同时间对阿霉素耐药细胞株Hep G-2/ADM生存率的影响;(3)Westernblot检测不同剂量及不同时间ABT-737对人肝癌阿霉素耐药细胞株Hep G-2/ADM中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3表达水平的影响;Westernblot检测不同剂量及不同时间ABT-737对人肝癌阿霉素耐药细胞株Hep G-2/ADM中自噬相关蛋白Beclin1及LC3表达水平的影响;(4)基因敲除技术敲除Beclin1,通过Westernblot方法检测自噬相关蛋白LC3蛋白的表达水平;(5)激光共聚焦显微镜观察自噬相关蛋白LC3点状聚集;(6)采用DCFH-DA荧光探针通过荧光显微镜观察细胞内ROS的变化;(7)采用Annexin V/PI双染法通过流式细胞术检测细胞凋亡率;(8)采用TUNEL法检测细胞凋亡。结果:(1)与Hep G-2细胞相比,Hep G-2/ADM细胞高表达Bcl-2,说明Bcl-2蛋白的高表达可能是导致Hep G-2细胞耐药的原因。(2)给予不同剂量的ABT-737作用于阿霉素耐药细胞株Hep G-2/ADM24h后,随着ABT-737剂量的增加,Hep G-2/ADM细胞存活率明显降低,凋亡率也明显增加,同时抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显降低,而促凋亡蛋白Bax表达量明显增加,Bax/Bcl-2的比值明显增加,裂解的Caspase3的表达明显增加,说明ABT-737可以诱导Hep G-2/ADM细胞凋亡。(3)随着ABT-737剂量的增加及时间的延长,自噬相关蛋白Beclin1的表达明显升高,同时LC3-II/LC3-I的比值明显增加,LC3II的点状聚集明显增加,说明ABT-737可以诱导阿霉素耐药细胞株Hep G-2/ADM发生时间-剂量依赖的自噬。当Beclin1基因沉默后,ABT-737组LC3-II/LC3I的比值明显减少,说明ABT-737诱导Hep G-2/ADM细胞自噬是Beclin1依赖性的。(4)随着ABT-737剂量的增加,Hep G-2/ADM产生的ROS增加,并伴有自噬的发生。给予ROS抑制剂NAC,抑制ROS生成后,LC3-II/LC3-I的比值明显降低,LC3II的点状聚集明显减少,说明ABT-737诱导Hep G-2/ADM细胞发生的自噬也是ROS依赖的。(5)进一步的实验证明加入NAC抑制ROS的产生后,Hep G-2/ADM细胞生存率降低的更加明显,细胞凋亡率增加的更加明显,裂解的Caspase3的表达增加更为明显,说明NAC可以增强ABT-737诱导的细胞凋亡。(6)加入3-MA抑制自噬后,Hep G-2/ADM细胞生存率降低的更加明显,Hep G-2/ADM细胞凋亡率增加的更加明显,裂解的Caspase3的表达增加更为明显,LC3-II/LC3-I的比值明显降低,Beclin1的表达明显降低,说明抑制自噬可以增加Hep G-2/ADM细胞对ABT-737的敏感性。结论:Hep G-2/ADM细胞与Hep G-2细胞比较,高表达Bcl-2,说明Bcl-2蛋白可能是导致Hep G-2细胞阿霉素耐药的原因。ABT-737能以时间-剂量依赖的方式诱导阿霉素耐药细胞株Hep G-2/ADM发生自噬,抑制Beclin1的表达或抑制ROS的生成都能通过抑制自噬增强高表达Bcl-2的肝癌耐药细胞株Hep G-2/ADM对ABT-737的敏感性。