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戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是一种非甲-非乙型肝炎病毒,1997年发现了第一例动物HEV株群,即猪源HEV,随后,各发达国家及印度等国陆续都有猪的相关报道,基因序列分析表明,从猪体内分离的戊型肝炎病毒与人的HEV有极高的基因同源性,确定戊型肝炎为一种人畜共患病。亟需发展一种特异而有效的方法来预防、诊断并治理病毒。到目前为止,还没有猪HEV ORF1、ORF2、ORF3的蛋白表位的系统筛选报道。目前国内外对猪戊肝的研究多限于局部区域的流行病学调查和一些简单的动物感染试验。市场上用于猪戊肝检测的试剂盒是用于人戊肝检测的试剂盒,虽然猪戊肝病毒与人戊肝病毒序列同源性很高,但是他们之间毕竟还是有些差别,用人的戊肝病毒表位来检测猪戊肝病毒特异不高,不能特异反映出猪戊肝流行规律。因此,有必要对猪HEV的抗原表位进行深入研究。为此,我们通过生物信息学分析,从开放阅读框(ORF)1、2和3中筛选并合成了12个多肽,即swHEV1-swHEV12。经过ELISA实验,选择多肽swHEV11作为最佳候选抗原,并将其作为包被抗原来开发以多肽为基础的猪HEV ELISA试剂盒。这一方面为研制猪HEV的快速诊断试剂,用于猪HEV流行的监控,另一方面为设计特异、安全、有效的猪戊肝疫苗用于猪戊肝的预防,控制猪戊肝的流行,阻断戊肝由猪向人传播打下坚实的基础。本研究分为两部分:一、猪戊型肝炎病毒抗原表位的筛选利用计算机软件DNAStar(Madison,Wisconsin,USA)预测并分析新疆株系(NCBI编号AY594199)swCH25 HEV非结构区(ORF1)和结构区(ORF2和ORF3)蛋白及多肽氨基酸序列的抗原性、表面性、亲水性和β-转角及β-折叠等二级结构,选出的氨基酸序列利用全自动多肽合成仪合成多肽,合成并纯化了12个多肽swHEV1-swHEV12。将合成的HEV多肽用预备好的HPLC进一步纯化,检测合成多肽的纯度。将这12个多肽分别包被在酶标板,通过间接ELISA试验检测经万泰试剂盒判定的猪HEV阳性猪血清和阴性血清,对IgG免疫反应活性检测,得出swHEV11多肽抗原为阳性抗原,阳性血清符合率是87.5%(21/24),阴性血清符合率是100.0%(6/6)。在12个合成多肽抗原中,确定swHEV11作为抗原性最强的多肽,选择多肽swHEV11作为最佳候选抗原。二、猪戊型肝炎病毒间接ELISA诊断方法的建立建立了应用猪HEV ORF3的一段序列合成肽swHEV11检测猪戊型肝炎病毒血清抗体的间接ELISA诊断方法,确定了抗原最适包被浓度为3μg/mL;血清最适稀释度为1:10,作用时间为30 min;酶标抗体最适稀释度为1:12000,作用时间为60 min。用合成肽swHEV11研制成猪HEV ELISA诊断试剂盒,与北京万泰人戊肝诊断试剂盒检测比较,符合率为73.4%(205/279),灵敏度和特异性分别为73.3%(200/273)和83.3%(5/6)。批内重复的变异系数<10%,批间变异系数<20%。结果表明多肽swHEV11是猪HEV的一个有效诊断抗原,可以用于发展高效的诊断试剂盒,能特异的并高敏感的检测血清样品中HEV抗体活性。综上所述,我们的研究结果表明,猪HEV ORF(ORF1、ORF2、ORF3)上存在最佳抗原表位,swHEV11位于HEV ORF3编码蛋白第91-114位氨基酸之间,这是第一次系统研究筛选猪HEV诊断多肽,我们的结果表明多肽swHEV11是猪HEV的一个有效诊断试剂,可以用于发展高效的诊断试剂盒,以便能特异的并高敏感的检测血清样品中HEV抗体活性。该方法的建立和所研制的猪戊型肝炎诊断试剂盒,灵敏度高,特异性强,稳定性合格,为猪戊型肝炎病毒抗体的检测和流行病学的调查提供了一种简便快速的血清学诊断方法。