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萜类化合物是植物、微生物中普遍存在的次级代谢产物。能够催化底物形成结构和立体化学多样性类异戊二烯天然产物的酶称为萜类合酶。对倍半萜合酶结构与功能的研究不仅可以深入了解萜类合酶的催化机制,还有利于获得种类繁多的萜类化合物,造福人类。在黄花蒿紫穗槐二烯合酶(Artemisia annua Amorpha-4,11-diene synthase,AaADS)中Glycine-439和Leucine-515均位于活性中心腔表面的两个不同的?螺旋上,且Glycine-439在不经典基序NSE/DTE上游第四个氨基酸残基的位置。本实验室前期研究发现,AaADS中439位氨基酸残基的侧链在活性中心腔所占的空间体积增大到一定程度时,酶与底物(E,E)-FPP结合后会影响到该酶的催化特异性,但是若同时将其对面的?螺旋上L515突变成侧链较小的A515后就能恢复酶的催化特异性。这种氨基酸之间的相互协同作用可以弥补天然倍半萜合酶发生突变以后产生的消极影响。然而,迄今为止还没有文献报道过AaADS的晶体结构,439位氨基酸残基突变后影响AaADS酶学特性的原因还有待深入研究。为了探讨NSE/DTE基序上游第四氨基酸突变对倍半萜合酶酶学特性的影响,本论文选取了两种晶体结构已知的倍半萜合酶:黄花蒿没药醇合酶(Artemisia annua Bisabolol synthase,AaBOS)和烟草马兜铃烯合酶(Nicotiana tabacum 5-epi-aristolochene synthase,NtEAS),经过定点突变,大肠杆菌诱导表达,孔雀绿测无机焦磷酸盐含量法测蛋白酶的动力学常数,GC-FID分析催化产物后,得出如下结果:1以(E,E)-FPP和(Z,E)-FPP为底物,AaBOS NSE/DTE基序上游第四残基侧链侵占活性中心腔较小空间体积时,酶的活性和催化产物特异性不受影响,当其侧链增大到一定程度后,酶的催化活性下降且催化产物特异性发生变化,副产物增多(C439),甚至失活(V439,I439);突变体(C439、V439)的NSE/DTE基序下游第64残基L515突变为侧链较小的A后,催化产物特异性接近恢复到野生型,失活突变体的催化能力也有所恢复(V439+A515)。催化活性虽有恢复,但整体仍较弱。2以(E,E)-FPP为底物,NtEAS NSE/DTE基序上游第四残基侧链侵占活性中心腔的空间体积发生特定变化时,对酶的催化产物特异性影响很大,当其侧链增大到一定程度后,酶的催化活性下降(I440);NSE/DTE基序下游第64残基侧链变小后(I440+A516),可以一定程度恢复酶的催化活性,但是酶的催化产物特异性无法恢复;而当以(Z,E)-FPP为底物时,上述协同作用对酶的影响和AaBOS类似。3综上,以(E,E)-FPP为底物时AaBOS和NtEAS中NSE/DTE基序上游第四氨基酸残基和下游第64氨基酸残基的协同变化对酶的催化特异性影响有明显差异,而当以(Z,E)-FPP为底物时此协同变化对酶的催化特异性影响相同。