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根据真菌漆酶铜结合区保守的氨基酸序列设计简并引物,扩增Trametessp.420基因组,结合长距离反向PCR(LD-IPCR),成功获得新型漆酶同工酶基因lacE。克隆得到的lacE序列长2717bp,包括完整的结构基因(2130bp)、5'-和3'-非编码区。根据已得到的Trametessp.AH28-2lacB和Trametessp.420lacA、lacB、lacC、lacD、lacE6条漆酶基因的DNA序列,设计特异引物,以逆转录产物为模板扩增得到相应基因的cDNA序列。序列分析结果表明,这些cDNA序列长度在1560~1578bp之间,与其它不同来源的真菌漆酶cDNA具有较高的一致性(>50%)。基于cDNA推导的氨基酸序列中均含有保守的10个His残基和1个Cys残基,且酶分子中含有多个潜在的N-糖基化位点。
将Trametessp.AH28-2lacB、Trametessp.420lacC克隆到表达质粒pPIC9K上,以α-因子前导序列为分泌信号,在毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115细胞中进行异源表达。经MD板和BMM板(含有底物ABTS)筛选得到分泌漆酶的阳性转化子,转化子在BMM液体培养基(含有0.3mmol/LCuSO4和0.8%丙氨酸(m/v))中20℃摇瓶培养。lacB的转化子GSb1在第13天酶活达到3.2×104U/L,lacC的转化子GSc1发酵9天的酶活为1.62×104U/L。
GSb1分泌的重组漆酶B(rLacB)对底物ABTS的Km为667μmol/L,为天然漆酶B(nLacB)的4倍(177μmol/L)。以ABTS为底物,rLacB的最适温度为45℃,低于nLacB的最适温度(55℃)。nLacB在pH5.4时最为稳定,而rLacB的最适稳定pH向碱性方向发生了漂移(pH7.4)。相对nLacB,rLacB具有更宽的pH稳定性范围(pH3.0-9.0)。
以纯化的rLacB、nLacB和GSc1分泌的重组漆酶C(rLacC)粗发酵液对终浓度50mg/L的染料进行脱色实验,结果表明,在较低的漆酶浓度下(终浓度8~60U/L),三种酶对三甲基类和偶氮类染料均有良好的脱色作用,小分子介体ABTS和HBT能够显著提高漆酶对染料的脱色效率和脱色速率。