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丙酮酸(pyruvicacid)是一种重要的医药、化工产品，其生产一直是生物化工领域的研究热点。酶催化法生产丙酮酸具有生产成本低、造成的污染少等优点，成为关注的焦点。乳酸是生产丙酮酸的原材料之一，目前为止人们发现自然界存在三种可以催化乳酸生成丙酮酸的酶类，分别是：乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)，乳酸氧化酶(lactateoxidase，LOX)和细胞色素氧化酶b2(flavocytochromeb2，FCB2)。其中FCB2研究较少，未见用于生产丙酮酸的报道。利用乳酸氧化酶生产丙酮酸已有报道，但由于在催化乳酸生成丙酮酸的过程中有过氧化氢的产生，导致丙酮酸的稳定性降低，所以使该酶在丙酮酸生产中的应用受到限制。催化乳酸生成丙酮酸的脱氢酶是NAD+非依赖性的乳酸脱氢酶，该酶催化乳酸生成丙酮酸，不依赖NAD+为辅酶，同时催化过程没有过氧化氢的生成，因此利用该酶生产丙酮酸具有广阔的应用前景。
酶催化法生产丙酮酸的核心是筛选具有高催化活性的菌株，该菌株不仅具有催化合成丙酮酸的高活性的酶或酶系，同时要满足催化条件简便易行，副产物少，后续加工程序简单等特性。研究该菌株的催化活性，确定关键酶的性质和催化机理，确定参与的代谢途径，对优化转化条件、提取纯化关键酶蛋白、构建相关的基因工程菌具有重要指导意义，并有助于最终达到提高转化效率，提高丙酮酸产量的目的。
经典的研究代谢途径的方法是推测和验证相结合，随着蛋白质组学的迅速发展，利用蛋白质组学研究代谢途径已经逐步代替了以往的方法，双向电泳技术自1975年问世以来已经成为一种分离蛋白质的有效工具，伴随着基质辅助激光解吸飞行时间质谱分析技术(matrixassistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS)的广泛应用，使得蛋白质鉴定变得较可行。并在一定条件下对蛋白质的表达进行分析为研究代谢网络的组成及功能提供了重要的信息；另外酶活性的测定也是探讨代谢通路的途径之一。
PseudomonasstutzeriSDM由本实验室从土壤中筛选得到，DL-乳酸是该菌的最佳碳源，在含有DL-乳酸为唯一碳源的培养基上培养并收集菌体作为休止细胞进行DL-乳酸的转化，最初转化体系中DL-乳酸的量是25.51g/L，30℃转化36小时后，检测到体系中丙酮酸的积累量是22.61g/L，转化率达到88.6﹪(w/w)，同时在转化液中检测到柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸和乙酸等有机酸。此属首次发现假单胞菌属细胞具有生产丙酮酸的能力，由于培养基配方简单，发酵液成分单一，转化率高，所以具有很广阔的应用前景。
利用双向电泳和MALDI-TOF质谱分析技术，首次得到了P.stutzeriSDM全细胞裂解液的双向电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis，2DE)谱图。对2DE谱图上重现率高的可视点进行胶内酶切，得到部分蛋白的肽质量指纹谱(PMF)，与假蛋白菌属已有PMF数据库进行比对，鉴定到匹配率高的蛋白质95种，其中14种蛋白质与乳酸氧化成丙酮酸过程相关，其中包括两种乳酸脱氢酶，分别是D-lactatedehydrogenase和L-lactatedehydrogenase(FMN-dependent)，从MALDI-TOF分析结果得到两种酶的分子量分别是45,394Da和66,540Da。从蛋白质鉴定的水平上确定了氧化乳酸生成丙酮酸的关键酶是NAD+非依赖的乳酸脱氢酶(NAD+-independentlactatedehydrogenase，iLDH)，此属首次在假单胞菌属细胞中发现iLDH。结合转化液中间产物的测定，初步确定乳酸氧化产生能量的过程通过三羧酸循环实现。该研究填补了P.stutzeriSDM代谢途径研究的空白，第一次建立了该菌的双向电泳图谱，首次完成了部分蛋白质的鉴定，为进一步优化P.stutzeriSDM转化乳酸的过程并提高丙酮酸的产量提供理论依据，也为今后分离纯化氧化乳酸的关键酶提供了重要线索。
P.stutzeriSDM在含有乳酸为唯一碳源的培养基上生长，菌体细胞利用并氧化乳酸生成丙酮酸的酶是NAD+非依赖性的乳酸脱氢酶(NAD+-independentlactatedehydrogenase，iLDH)，对细胞不同组分的酶活性测定表明，iLDH的活性定位在细胞膜上，并且发现在膜上同时存在两种立体异构专一性的酶：L-iLDH和D-iLDH。用含有不同碳源的培养基培养菌体，结果显示两种酶都是非组成型的表达蛋白，任何一种对映体的乳酸都可以诱导两种酶的表达。酶促动力学研究表明，P.stutzeri中iLDH催化的反应遵循Michaelis-Menten模型，L-iLDH的米氏常数比D-iLDH的米氏常数高，两种酶的氧化速度不同，并且各有特异的电子受体，不同的电子受体又各有特定的抑制剂。L-iLDH的活性在55℃时稳定性比D-iLDH的稳定性好，D-iLDH在55℃变性失去活性。iLDH对底物有严格的选择性，草氨酸完全抑制两种iLDH的活性，草酸表现为混合型的抑制作用。Mg2+是iLDH的金属离子激活剂，Cu2+和Mn2+是其金属离子抑制剂。我们还发现当P.stutzeriSDM利用含有乳酸和葡萄糖混合培养基生长时，只有当乳酸消耗尽时才利用葡萄糖，具有优先利用乳酸的特点。上述得出的iLDH活性调节的结论为进一步优化培养基配方，培养条件包括温度pH等因素的探索提供了理论依据，并为提高丙酮酸转化效率奠定了基础。
针对双向电泳过程中膜蛋白质组研究面临的问题，通过不同表面活性剂对膜组分作用的不同，本实验探讨了几种富集P.stutzeriSDM膜蛋白的方法。通过超速离心的方法纯化得到膜蛋白，采取裂解液直接溶解的方法和分别用TritonX-100、CHAPS、SLS、SDS溶解的方法处理，然后用TCA-丙酮沉淀的方法从上清中沉淀蛋白，分别进行双向电泳，得到五种不同处理方法下的膜蛋白的2DE图谱，对2DE图谱分析可见，不同的表面活性剂对膜蛋白的溶解有选择性，TritonX-100的2DE图谱无论从蛋白质点的形状以及蛋白点的数量等均优于其它处理组。结合MALDI-TOFMS分析技术进行蛋白质鉴定，膜蛋白直接用裂解液溶解的样品得到匹配率高于75﹪的蛋白质20种，TritonX-100鉴定到的蛋白质种类较多，共46种。利用十二烷基肌氨酸处理膜蛋白，鉴定到蛋白质28种，其中外膜蛋白为15种，占鉴定到蛋白质的58﹪，十二烷基肌氨酸是提取制备外膜蛋白最佳的选择。鉴定到的蛋白质中以酸性和中性蛋白质居多，碱性蛋白较少，故选择表面活性剂处理的方法有其局限性。
应用双向电泳技术鉴定疏水性的膜蛋白，由于在第一向等电聚焦时许多蛋白质发生了沉淀而使其在膜蛋白质组研究中的应用受到了限制，本实验利用非变性蓝色聚丙烯酰胺凝胶电泳(bluenativepolyacrylamidegelelectrophoresis，BN-PAGE)技术对纯化得到的膜蛋白进行了分离，探讨了一种温和的表面活性剂十二烷基麦芽糖苷(DM)对膜蛋白的溶解作用，通过不同浓度DM对P.stutzeriSDM膜蛋白作用差异的比较，结合iLDH活性检测，确定2﹪的DM浓度是最佳选择。第一向bluenativePAGE采用了CCBG250提供离子基团对膜蛋白进行了初步分离，进而第二向SDS-PAGE对第一向初步分离的条带进行了再次分离，得到了较为单一的蛋白质点。成功建立了iLDH活性染色方法，对电泳结束后的胶进行活性染色，得到了单一的活性点。首次利用2DBN/SDS-PAGE的方法处理P.stutzeriSDM的膜蛋白，并结合MALDI-TOF-MS分析技术，鉴定到29种膜蛋白，与通过2DE方法分离鉴定到的蛋白没有重叠性，弥补了通过经典的2DE方法鉴定膜蛋白的不足。结果证明利用BN-PAGE结合SDS-PAGE，并利用质谱分析手段，对于疏水性较强的膜蛋白来说，是一种相对廉价、直接、快速的分析手段。
P.stutzeriSDM以乳酸为唯一碳源时生长最好，并且是唯一可以产生并积累丙酮酸的培养基，在乙醇为唯一碳源时，生长缓慢，几乎没有丙酮酸的产生。本文依赖双向电泳和MALDI-TOFMS技术，从比较蛋白质组学的角度揭示了不同碳源条件对蛋白质表达的影响。本实验对蛋白表达差异点进行了比较，部分蛋白点进行了MALDI-TOFMS分析，并对差异显著的两个点进行了ESIMS分析，在得到鉴定的蛋白质中，属于乳酸诱导表达的蛋白质有8种，表达增高的有6种；乙醇诱导表达的蛋白质有6种，表达增高的有8种。这为今后菌株的优化工作及相关蛋白的纯化和工程菌的构建奠定了理论基础，填补了P.stutzeriSDM比较蛋白质组研究的空白。