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大豆是世界上重要的蛋白和油料作物,冷冻和盐碱等不利环境条件对大豆产量造成严重损失。植物在面对逆境时,主要通过调节一系列基因的表达响应逆境,以减少自身的伤害。对大豆抗逆机制进行研究,从而对大豆进行分子改良,提高大豆对逆境胁迫的适应性是提高大豆产量的一个有效途径。
低温是主要的环境胁迫因子之一。在大豆生长的关键时期,天气突然变冷会对大豆产量造成严重影响,目前大豆中抗冷机制的研究较少。本研究利用基因芯片技术在大豆中找到受低温诱导极其强烈的基因,InducedbyCold(GmICO),对其进行克隆和抗冷功能研究。生物信息学分析发现GmICO蛋白含有5个RCC1-repeats结构域,属于RCC1家族蛋白;启动子序列分析发现,GmICO启动子中含有3个ABRE、3个WRKY、3个MYC和1个MYB逆境响应元件;RT-PCR和Real-timePCR都显示GmICO在正常条件下表达微弱,但是特异受低温诱导,而对NaCl、ABA和PEG(模拟干旱)等处理没有响应,以GmICO启动子融合GUS报告基因的组织化学染色分析也显示GmICO受冷诱导表达;GFP的亚细胞定位显示GmICO蛋白在细胞核中表达,且冷处理不改变GmICO的核定位情况。GmICO在拟南芥中过表达可以明显增强转基因植株的耐冻性,且在-6℃和-8℃冷冻下GmICO过表达拟南芥植株的电导率比值比野生型Col-0明显降低;进而发现GmICO在拟南芥中过表达造成抗冷基因COR15a表达明显升高,很可能是植物抗冻能力提高的主要原因。对黄淮海地区品种中黄39、Nannong99-6和东北地区品种黑河19、黑农51中GmICO的表达模式比较分析发现,东北品种中低温处理对GmICO的诱导比黄淮海地区品种明显强烈,且GmICO启动子在Nannong99-6中比黑农51中有大约1000bp的缺失。这些说明在长期的演化中,GmICO在植物对低温适应中起关键作用。
大豆根瘤固氮对大豆高产稳产非常关键。大豆结瘤和根瘤固氮对盐胁迫非常敏感,但我们对根瘤生长发育和固氮过程响应盐胁迫的分子机制认识极少。我们利用Solexa高通量测序技术对盐胁迫处理前后的大豆功能根瘤小RNA文库进行了深度测序,共检测到属于148个miRNA家族的275个miRNA,通过序列比对和pre-miRNA序列的发夹茎环结构预测,发现其中76个miRNA为已知的miRNA,属于43个miRNA家族;199个miRNA为新的miRNA,属于105个miRNA家族,其中有21个家族的60个新miRNAs属于已知的miRNA家族;对盐处理和非盐处理的miRNA读取频率比较,发现5个已知miRNA和26个新miRNA受盐胁迫诱导上调表达超过2倍,12个已知miRNA和9个新miRNA受盐胁迫下调表达超过2倍;23个新miRNA只在盐胁迫处理的大豆根瘤小RNA库中检测到;46个新miRNA只在正常条件生长的大豆根瘤小RNA库中检测到。这些miRNA在根瘤中表达并且对盐胁迫响应,推测其在盐胁迫条件下对根瘤的正常生长发育及固氮有重要作用。
本论文对大豆中抗冷基因GmICO的研究为揭示大豆抗低温分子机制和遗传改良大豆耐低温能力提供了新的科学依据;对大豆根瘤中盐胁迫响应miRNA的研究结果,不仅丰富了大豆中miRNA的数量,还明确了miRNA在根瘤对盐胁迫响应中的重要调控作用,为进一步研究大豆在盐胁迫下的共生固氮调控的分子机制奠定了重要基础,也为分子育种改良盐碱地中大豆的固氮效率提供了新思路。