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第一部分：尽早干预对db/db糖尿病小鼠胰岛p细胞保护的探讨目的：探讨在血糖正常期和糖尿病早期采取不同方式对db/db小鼠进行干预对胰岛p细胞的保护。方法：(1)选取血糖正常的雄性db/db小鼠98只,分别在4周龄(血糖正常)和6周龄(糖尿病早期)时进行干预,各分为4个干预组：利拉鲁肽(Liraglutide,LIRA).吡咯列酮(Pioglitazone,PIO)、限制饮食(Calories restriction,CR)和运动(Exercise,EX),另设1个对照组。入组前及干预结束时测定糖化血红蛋白(Glycosylated hemoglobin,HbAlc).每周监测小鼠空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG).体重和进食量。小鼠12周龄时结束干预,分别进行腹腔注射糖耐量试验(Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)和胰岛素耐量试验(Insulin tolerance test,ITT)评价糖耐量、胰岛素释放反应及胰岛素敏感性。检测血浆甘油三酯(Triglyceride,TG).游离脂肪酸(free fatty acids,FFA).脂联素和胰高血糖素浓度。免疫组织化学方法检测胰岛p细胞质量、增殖(Brdu)和凋亡(TUNEL)；检测胰岛PDX-1和IRS-2表达变化。实时荧光定量PCR检测胰腺GRP78.CHOP mRNA.microRNA miR-34a.miR-375表达,普通PCR检测胰腺XBP-1/spliced XBP-1 mRNA表达.Western blot检测胰腺内质网应激标志物GRP78和CHOP蛋白表达。(2)35只8周龄db/db小鼠分为4周：对照组,PIO组,LIRA组,及PIO+LIRA联合治疗组,治疗4周后行IPGTT和ITT试验。测定血浆胰岛素、脂联素、游离脂肪酸和甘油三酯浓度。免疫组织化学方法检测胰岛β细胞质量、增殖(Brdu)和凋亡(TUNEL)水平。结果：1.(1)与未处理组相比,干预结束时各组血糖显著降低(HbA1c：对照组7.3±0.3%,4周龄干预组4.9±0.8%,6周龄干预组5.5士O.9％,P<0.001)；IPGTTl 20min血糖曲线下面积显著降低(AUCglu:对照组4568±190 mmol/1*min,4周龄干预组2306±727mmol/l*min,6周龄干预组3559士903 mmol/lmin,P<0.001)。不同干预方式之间存在差别(HbA1c：LIRA组4.9±0.5%,PIO组4.3±0.4%,CR组5.4±0.7%,EX组6.1±0.6%, P<O.OOl),糖耐量的改善与HbAlc一致(AUCglu:LIRA组2558±639mmol/l*min, PIO组1662±483 mmol/l*min, CR组3262±613mmol/l*min, EX组3904±610 mmol/l*min, P<0.001)。(2)空腹胰岛素较对照组升高(对照组：5.7±2.5ng/ml,4周龄干预组11.0±3.0ng/ml,6周龄干预组9.1±4.6ng/mlP<0.01),4周龄干预组较6周龄干预组轻度升高(P<0.05)。除LIRA (12.3±3.4ng/ml, p=0.001)以外,其它组小鼠空腹胰岛素水平的差别没有统计学显著意义。胰岛p细胞的胰岛素分泌反应得到不同程度的恢复,IPTGTT120min胰岛素曲线下面积(AUCglu:对照组799±186ng/ml*min,4周龄干预组1410±595ng/ml*min,6周龄干预组1216±347ng/ml*min, P<0.05)。对照组胰岛素曲线低平,LIRA组和PIO组在30min出现分泌高峰,升高幅度分别为2.0倍和2.1倍,二者没有统计学差异。CR组胰岛素分泌高峰延迟,EX组胰岛素分泌曲线和对照组类似。(3)血浆TG、FFA,胰高血糖素水平降低,4周龄干预组和6周龄干预组相比均没有统计学差异。PIO组脂联素水平升高(9.5±1.6vs.l5.3±3.9mg/l, P<0.05),其他组与对照组无显著差别。(4)胰岛免疫组织化学分析显示,对照组胰岛肥大,免疫组化显示胰岛β细胞减少,胰岛素染色变浅,呈严重脱颗粒。胰岛α细胞增多,分布紊乱,由胰岛周边向中心迁移,散在分布在整个胰岛。胰岛素染色面积明显增加(对照组27.0±1.5%,4周龄干预组50.8±6.4%,6周龄干预组44.5±8.1%,P<0.001)。与对照组相比,PIO组胰岛明显变小,胰岛p细胞增多,无脱颗粒现象,胰岛α细胞分布正常；LIRA组和CR组胰岛肥大,胰岛p细胞增多,脱颗粒较对照组减轻,胰岛a细胞分布改善；EX组胰岛肥大,p细胞数量和胰岛素含量轻度增多,脱颗粒及胰岛α细胞分布无明显改善。胰岛p细胞的质量和血糖的控制呈现一致的趋势。LIRA组和CR组胰岛p细胞增殖较对照组明显增多(P<0.05)。p细胞凋亡在LIRA、PIO和CR组受到不同程度的抑制。(5)胰岛PDX-1和IRS-2表达在LIRA组和PIO组均较对照组明显增加,其中LIRA组PDX-1表达较PIO组多,而PIO组IRS-2表达显著强于LIRA组。(6)LIRA组和PIO组胰腺内质网应激显著抑制,CR组和EX组没有明显变化。(7)LIRA降低miR-34a (71%, P<0.05)和miR-375 (51%, P<0.05)表达。2.各治疗组血糖显著降低,PIO+LIRA联合治疗组降糖效果优于单药组(糖化血红蛋白对照组：7.3±0.4%, PIO:4.9±0.6%, LIRA:5.5±0.4%, PIO+LIRA:4.5±0.6%);与对照组相比IPGTT120min血糖曲线下面积降低56%(P<0.001), IPGTT120min胰岛素曲线下面积增加91%(P<0.01)；脂联素升高95%(P<0.05)；游离脂肪酸降低29%(P<0.05),甘油三酯降低49%(P<0.01),均优于单药组；胰岛组织切片胰岛素阳性面积增加1.7倍(P<0.001),胰岛新生β细胞比例增加2倍(P<0.01),均优于单药组。联合治疗显著改善胰岛a细胞分布,促进胰岛β细胞增殖,恢复正常的胰岛形态。结论：1.尽早干预更有利于对胰岛β细胞及其功能的保护,提示2型糖尿病尽早干预的必要。2.利拉鲁肽直接保护胰岛β细胞及其功能,但只能部分代偿严重的胰岛素抵抗。3.吡格列酮联合利拉鲁肽治疗相比单药更好地改善db/db小鼠糖脂代谢和保护胰岛β细胞功能。第二部分：京尼平抑制饱和脂肪酸诱导的HepG2细胞凋亡和内质网应激目的：探讨京尼平减轻棕榈酸对HepG2细胞毒性的作用及机制。方法：HepG2细胞分为空白组、棕榈酸组、京尼平组和京尼平预处理的棕榈酸组,分别用牛血清白蛋白、棕榈酸(1mmol/1)、京尼平(20μmol/1)或京尼平(20μmol/1)预处理30mmin后棕榈酸(1mmol/1)孵育24h,检测细胞活力(MTT)及乳酸脱氢酶(LDH)释放；孵育16h后流式细胞术和Hoechst染色检测细胞凋亡；孵育6h后实时荧光定量PCR检测、GRP78、CHOP基因表达,PCR结合电泳检测XBP-1裂解。结果：和空白组相比,棕榈酸减低HepG2细胞活力、增加LDH释放(P<0.01),增加HepG2细胞凋亡(P<0.05),上调GRP-78和CHOP表达(P<0.05)及XBP-1裂解；和棕榈酸组相比,京尼平增加细胞活力(P<0.05)、减少LDH释放(P<0.05),显著抑制细胞凋亡(P<0.01),降低GRP-78和CHOP基因表达(p<0.01)及XBP-1裂解。结论：京尼平具有抗棕榈酸诱导的肝细胞凋亡的作用：可能与抑制内质网应激有关。第三部分：PPAR-γ和PPAR-α激动剂改善HepG2细胞胰岛素抵抗及机制研究目的：探讨过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPAR-γ)或α(PPAR-α)在肝细胞糖代谢和胰岛素抵抗改善中扮演的角色。方法：体外培养人肝癌细胞系HepG2细胞并用高浓度棕榈酸处理建立胰岛素抵抗模型,分别给予PPAR-γ激动剂吡格列酮或高选择性PPAR-a激动剂WY 14643处理,酶法测定葡萄糖的消耗量和糖酵解产物乳酸、丙酮酸；实时荧光定量PCR测定PPAR-γ, PPAR-α,及糖酵解相关基因烯醇酶1 (ENO1)、肝型6-磷酸果糖激酶(PFKL)、磷酸甘油酯激酶(PGK1)和丙酮酸激酶M2 (PKM2) mRNA表达的变化。结果：吡格列酮增加胰岛素抵抗的HepG2细胞葡萄糖消耗,诱导糖酵解相关基因PFKL、PGK1和PKM2表达显著上调,糖酵解产物乳酸和丙酮酸生成增多。WY14643部分改善HepG2细胞胰岛素抵抗,对糖酵解相关基因表达及糖酵解产物生成没有显著影响。吡格列酮或WY 14643对PPAR-γ或PPAR-amRNA的表达没有影响。结论：PPAR-γ激动剂通过促进糖酵解改善HepG2细胞的胰岛素抵抗。