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大鼠气管干细胞增殖分化过程中Oct3/4、Nanog和Sox2的表达及意义前言干细胞是存在于胚胎和成体中的一类特殊细胞,它能长期的自我更新,在特定的条件下具有分化形成多种终末细胞的能力。成体干细胞为存在特定组织中的干细胞,由于无伦理学方面的困扰,成体干细胞的应用越来越受到人们的关注。随之成体干细胞增殖分化调控的机制也成为研究的重点,有学者提出胚胎干细胞相关基因的概念,包括:Oct3/4、Nanog和Sox2等。它们在胚胎干细胞中有表达,而在成熟组织细胞中无表达。这些胚胎干细胞相关基因可以维持胚胎干细胞未分化状态,保持干细胞的多向分化潜能。另外,Oct3/4、Nanog和Sox2的激活能使体细胞发生再编程,表现出未分化细胞特征,使其具有干细胞多潜能分化的能力,为成体干细胞应用提供理论基础。气管上皮在正常情况下更新缓慢,但在损伤修复时能再生以维持其完整性,这说明气管上皮中存在干细胞,只有在损伤的过程中才能激活其潜能。我们实验室已经建立了5-FU引发离体气管损伤修复模型,这一模型成功再现了气管干细胞的增殖分化过程,使气管干细胞增殖分化机制的初步研究成为可能。因5-FU属抗嘧啶类代谢药,经5-FU作用后,气管上皮增殖期细胞脱落,基底膜上残留的细胞为G0期细胞,并出现了干细胞标记物ABCG2的表达,撤除5-FU后气管上皮经扁平细胞、立方细胞,直至48小时恢复到假复层纤毛柱状上皮,证明气管干细胞存在于对5-FU抗性G0期细胞中。但对这一过程的调控机制还所知甚少。本研究利用5-FU引发离体气管损伤修复模型,观察在气管干细胞增殖分化过程中Oct3/4、Nanog和Sox2的动态变化,并探讨其维持气管干细胞未分化状态的分子机制。材料和方法一、离体大鼠气管损伤修复模型的制备及5-azaC处理取约200克左右的Wistar大鼠,雌雄不限,水合氯醛麻醉,无菌条件下取出气管,PBS冲洗,置于DMEM/F12培养液中（含10%胎牛血清）。取正常气管,剪取一气管环固定,留做石蜡切片,灌入蛋白酶ⅩⅣ（0.5mg/ml）,结扎另一端,4℃消化过夜,收集消化液,加FBS至终浓度为2.5%终止酶反应收集正常气管上皮细胞于2mlEppendorf管中,-70℃冻存,留做mRNA提取。其余气管组织分为5-FU作用组和5-azaC处理组。5-FU作用组为5-FU作用12小时后,置于DMEM/F12培养液中（含10%胎牛血清）,分别于换液后0、3、6、12、24、48小时取出气管组织分别固定,留做石蜡切片;5-azaC处理组在5-FU作用后,当换液后24小时,换为含有1μM 5-azaC DMEM/F12（含10%胎牛血清）继续培养,方法同上,6小时后取出气管组织分别固定,留做石蜡切片;消化,收集细胞于2mlEppendorf管中,-70℃保存,以备DNA,RNA和蛋白提取。二、RT-PCR检测按TrizolTM试剂使用说明提取气管上皮细胞总RNA,检测它的浓度,纯度和完整性。按逆转录试剂盒使用说明操作,选用Oligo-dT做引物合成第一链cDNA,逆转录条件为:30℃10min,40℃40min,99℃5min,5℃5min;PCR反应条件为:94℃变性2min后,94℃30s,退火,72℃1min,进行35个循环,最后于72℃延伸7min。扩增产物使用2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色分析表达结果,测灰度值,统计。相同条件下用β-actin作为内对照。三、蛋白印迹检测按蛋白抽提试剂盒说明抽提气管上皮细胞总蛋白,SDS-PAGE电泳,50V恒压湿转120mins,BSA室温封闭2hrs,一抗4℃孵育过夜,二抗37℃孵育2hrs,DAB显色。转膜后各步之间均用洗膜液洗膜3次,每次5mins。相同条件下用β-actin作为内对照。四、间接免疫荧光检测气管上皮Oct3/4,Nanog和Sox2的表达石蜡切片脱蜡至水,抗原修复,非免疫动物血清封闭,一抗分别为山羊抗Oct3/4,兔抗Nanog和山羊抗Sox2;二抗分别TRITC标记兔抗羊IgG和FITC标记羊抗兔IgG。DAPI复染细胞核。50%缓冲甘油封片,荧光显微镜OlympasBX51下观察并照相。阴性对照实验:用等量的0.01mol/L PBS代替一抗,其余步骤同前。五、免疫组化检测气管上皮CK14和P63的表达石蜡切片脱蜡至水,高温高压抗原修复,非免疫动物血清封闭,一抗分别为山羊抗CK14和山羊抗P63,4℃孵育过夜;二抗37℃孵育30min。DAB显色。显微镜下观察并照相。阴性对照实验:用等量的0.01mol/L PBS代替一抗,其余步骤同前。六、甲基化特异性PCR检测以酚-氯仿抽提法提取气管上皮细胞DNA,参见试剂盒说明进行甲基化修饰,然后进行甲基化特异性PCR（MSPCR）反应,MSPCR反应条件为:95℃变性3min后,98℃10s,退火,72℃1min,进行40个循环,最后于72℃延伸7min。扩增产物使用2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色分析表达结果,测灰度值,统计。七、统计分析所有的RT-PCR实验和蛋白印迹实验均独立重复三次,所得数据的值用均数（means）±标准偏差（SD）来表示。用SPSS 11.5软件对所得数据进行单因素方差分析,当P＜0.05认为有统计学意义。结果1、5-FU诱导损伤修复过程中CK14、P63和Oct3/4的表达变化正常气管上皮几乎没有Oct3/4的表达,去除5-FU作用后0h,Oct3/4少量表达,随后表达量逐渐增高,至6h达到峰值,随后逐渐降低,至48小时几乎恢复至正常水平;正常气管上皮CK14和P63高表达,去除5-FU作用后0h,CK14和P63几乎不表达,之后表达逐渐增加,至48h几乎恢复正常水平。2、间接免疫荧光检测5-FU作用后大鼠气管上皮Oct3/4、Nanog和Sox2的表达正常气管上皮几乎没有Oct3/4、Nanog和Sox2的表达,5-FU打击后0h,出现Oct3/4、Nanog和Sox2阳性细胞,随后逐渐增多,至6h达到高峰,随后逐渐降低,至48h几乎恢复至正常水平。Oct3/4、Nanog和Sox2的定位相同,均位于相同的细胞中。3、5-FU诱导损伤修复过程中Oct3/4、Nanog和Sox2的表达变化蛋白印迹检测大鼠气管上皮损伤修复过程中Oct3/4、Nanog和Sox2的蛋白水平发现,正常气管上皮没有Oct3/4、Nanog和Sox2表达。5-FU打击后0h,出现Oct3/4、Nanog和Sox2的表达,并随着气管上皮的修复逐渐增加,在6h达到高峰,随后逐渐降低,至48h降至正常水平。RT-PCR的结果与蛋白印迹的结果相同。4、MSPCR检测5-FU作用后大鼠气管上皮Oct3/4、Nanog和Sox2的启动子甲基化状态选取几个有代表性的时间点,分别选取正常气管上皮细胞、5-FU作用后0h的细胞、5-FU作用后恢复6h的细胞和恢复48h的气管上皮细胞进行检测。结果显示在正常气管上皮细胞中仅存在三种基因的甲基化条带,而5-FU作用后0h和6h出现了这三种基因的甲基化和未甲基化条带,48h也只有三种基因的甲基化条带。5、5-azaC处理对大鼠气管上皮损伤修复的影响HE染色显示,5-FU诱导损伤后,气管上皮细胞恢复24h出现分化时用5-azaC作用,与单纯5-FU作用对照组相比,气管上皮的形态出现差异。单纯5-FU作用对照组,气管上皮于30h后出现双层,而5-azaC作用组,气管上皮呈现扁平细胞。免疫荧光结果检测Oct3/4、Nanog和Sox2的表达,5-azaC作用组Oct3/4、Nanog和Sox2阳性的细胞数明显高于单纯5-FU作用组。RT-PCR与荧光结果相同。结论1、5-FU作用后,经48小时气管上皮可基本恢复正常形态。2、Oct3/4可作为气管干细胞标志物,此细胞CK14阴性、P63阴性,可向基底细胞、纤毛细胞、粘液细胞分化。3、Oct3/4、Nanog和Sox2在气管干细胞增殖分化的过程中发挥了重要的作用。4、在气管干细胞的增殖分化过程中,Oct3/4、Nanog和Sox2表达的动态变化与其启动子甲基化调控有关。