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研究背景在我国,病毒性肝炎尤其是慢性乙型肝炎感染率及发病率高,肝衰竭成为慢性肝病患者的主要死亡原因之一。肝衰竭的发生、发展及预后的差异性与肝细胞的凋亡及再生相关,一系列的复杂因素包括大量肝细胞坏死、凋亡及退化参与其中。肝再生是一个十分复杂的过程,一系列细胞因子包括肝细胞生长因子、表皮生长因子、转移生长因子及胰岛素等。但上述细胞因子均无法解释器官特异性肝细胞再生。人肝再生增强因子(hALR)是最新发现的一种与肝再生密切相关的细胞因子,研究表明hALR是目前已知唯一对肝源性细胞有特异性增殖刺激活性的因子,能显著促进肝细胞再生。在非激活状态下ALR在肝细胞中低水平持续表达,而当肝细胞收到损伤肝再生过程启动时,ALR表达量大大增加并从肝细胞内释放入血。有动物实验发现在肝再生早期外周血ALI泳平即有明显上升且较其它肝再生相关的细胞因子早,血清ALR水平良好反映肝脏ALR表达水平及肝脏再生情况。本研究通过重组克隆制备获得高纯度hALR蛋白及抗hALR单克隆抗体,通过免疫组化、定量PCR及ELISA等方法比较不同类型及不同预后慢性肝病(包括肝衰竭、肝癌、慢性乙型肝炎等)患者肝组织hALR分布、mRNA表达水平及血清hALR表达水平差异,以及同一肝衰竭患者不同疾病发展阶段hALR水平变化,进一步阐明hALR在肝细胞再生中的可能作用机制,探讨hALR在肝衰竭发生、发展及转归中的地位及意义。方法以肝移植正常人供肝总mRNA为模板,以RT-PCR获取全长hALR cDNA,构建合成蛋白标签、蛋白酶切位点及分泌信号肽序列,然后将hALR.蛋白标签、蛋白酶切位点及原核表达用分泌信号肽以一定的连接顺序同时克隆到E.coli表达载体pET28a(+)中,转化E.coli BL21,制备工程菌,摸索诱导表达条件,避免形成大量包涵体,使hALR以分泌蛋白的形式在大肠杆菌中得以高表达,然后利用阴离子交换层析、阳离子交换层析和分子筛等技术,纯化重组hALR,使制备的重组hALR纯度在98%以上。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-Blot)等方法,利用重组蛋白上带有的蛋白标签,鉴定特异性目的蛋白的表达。用相应的蛋白酶切去蛋白重组多肽后获取天然结构hALR蛋白,利用免疫共沉淀和质谱技术,对重组hALR的分子量、等电点等生物学性状进行鉴定。以hALR蛋白为抗原腹腔注射免疫Balb/c小鼠,以Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞作为滋养细胞,将小鼠脾细胞与SP2/O细胞混合接种,采用间接ELISA筛选分泌抗hALR抗体的阳性杂交瘤细胞株,将杂家瘤细胞腹腔接种于腹水小鼠,抽取腹水-20。C保存。用hALR蛋白以western-b1ot的方法鉴定与单克隆抗体的特异性结合。以不同细胞因子包被进行间接ELISA检测,排除单克隆抗体的交叉反应。入选临床病例,获得知情同意后用肝穿刺活检的方法获取肝组织,部分接受原位肝移植的肝衰竭患者可获取其肝组织分切成小块,固定后腊块包埋保存,部分冻存于液氮罐。同时在其疾病的第1、3、7、14及21天抽取外周血,离心后将上清分别冻存于-20℃。将hALR蛋白稀释成一系列浓度,与hALR单克隆抗体以Elisa方法制作hALR浓度与吸光值的标准曲线,参照标准曲线,以ELISA的方法检测外周血hALR水平,将腊块包埋的肝组织切片,常规制片后脱蜡,羊血清封闭,一抗为抗hALR抗体,二抗为HRP标记兔抗鼠IgG,DAB显色,苏木素复染,显微镜下观察并拍照,同时设立阴性对照制片,观察hALR在肝组织内分布情况。用real-time PCR的方法检测肝组织内ALRmRNA表达水平,β-actin mRNA水平被用来衡量不同批次nRNA的cDNA合成及逆转录效率。结果获取全长375kb的ALR cDNA并成功克隆于pET-28a (+),表达、纯化、鉴定hALR蛋白,纯化的ALR质谱法检测ALR分子量24.712KD,等电点为4.63,并成功获取抗hALR单克隆抗体。定量PCR结果显示ALR mRNA在肝癌组织中高表达(10E6.24(1.74×106) copies/μl),在肝衰竭恶化接受肝移植组低表达(10E3.45(2.82×103) copies/μl),在正常人肝组织中低表达(10E4.31(2.04×104) copies/μl). Elisa研究血清ALR表达水平结果显示：血清ALR水平肝衰竭肝功能好转组(1613.5±369.6pmol/ml)显著高于肝衰竭肝功能恶化组(462.3±235.8pmol/ml).原发性肝癌组(917.9±332.7pmol/ml)、慢性乙型肝炎组(969.2±332.5pmol/ml)及正常人对照组(806.9±240.8pmol/ml)血清AL＆水平接近,差异无统计学意义。结论在肝衰竭患者中,血清ALR水平的高低反映了肝脏再生程度的高低。高的血清ALR水平提示肝脏再生活跃而预后较好。低的血清ALR水平提升肝脏再生差而导致死亡或必须接受肝移植。