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人类大规模使用有机锡化合物始于上世纪中期,作为各种杀虫剂、除草剂、PVC稳定剂以及海洋船只防污涂料等,大量的有机锡化合物被生产并用于工农业当中。由于有机锡化学性质稳定,不易降解,环境中特别是水体中有机锡的污染比较严重,因此对有机锡污染的研究引起了人们的关注。
有关环境中有机锡污染的研究,目前较多的集中于其对鱼类、藻类、微生物等各种生物的毒理作用以及有机锡在环境中的污染分布级变化,对于有机锡的生物降解还缺乏广泛而深入的研究。微生物特别是细菌对环境中有机锡的降解或分解尤为关键,但其降解机制至今仍知之甚少。
本学位论文工作首先筛选了三苯基锡(TPT)分解菌株。以M9培养基为基本培养基,琥珀酸钠作为外加碳源,从25种菌株中筛选得到TPT分解能力最强的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CGMCC1.860,并对其分解机制进行了研究。实验结果表明TPT无法作为唯一碳源使用。TPT的分解发生在胞外,即分解因子存在于培养基上清液中。在培养基中添加Fe3+进行培养,所得上清液仍具有TPT分解能力。通过紫外和荧光两种方法检测,在含Fe3+培养基中,前人报道的能够分解TPT的铁螯合剂—绿脓菌荧光素(pyoverdine,PVD)的产生已经被完全抑制,但TPT分解能力并没有因此而降低,该细菌培养基上清液仍具有TPT分解活性,这说明在该培养基上清液中存在不同于PVD的未知的TPT分解因子。
通过对未知的TPT分解因子的性质的初步研究,观察到培养基上清液的乙酸乙酯萃取物具有TPT分解活性,并用薄层层析(TLC)对其进行了纯化。用三氯甲烷∶乙酸∶乙醇(95∶5∶2.5,v/v/v)和三氯甲烷∶乙酸∶乙醇(95∶5∶5,v/v/v)两种展开剂依次展开,获得纯的活性成分,其比移值Rf=0.35~0.40,在紫外(UV)灯下呈黄绿色,与FeCl3反应呈红棕色。通过高分辩电离质谱图(HREI-MS)、高分辩电喷雾离子化质谱图(HRESI-MS)以及核磁共振(NMR)图谱分析确定了其化学结构,它是一种己知的另一种铁螯合剂Pyochelin(PCH)。关于PCH具有分解污染物,特别是分解有机金属化合物的能力,至今未见报道。
接着对PCH分解TPT的机制进行了探索。把PCH与Fe3+混合,所形成的铁螯合物Ferripyochelin(FePCH),在Tris-HCl缓冲液(pH8.0)体系中,其分解TPT的能力明显高于PCH。通过电子顺磁共振(EPR)和高效液相色谱(HPLC)两种方法检测,观察到体系中产生了羟自由基(HO·),由此我们推测该体系可能通过产生的羟自由基分解TPT来提高其分解能力。在体系中添加羟自由基清除剂甲醇(MeOH)和二甲亚砜(DMSO),以及羟自由基产生抑制剂过氧化氢酶(CAT),发现羟自由基的产生减少,相应的TPT的分解也随之减少;相反在体系中添加过氧化氢(H2O2),增加了羟自由基,同时TPT的分解也得到增强。以上实验结果表明,在FePCH存在的情况下,反应体系中产生了羟自由基,并且产生的羟自由基参与了TPT的分解。
另外,FePCH与TPT混合物的电喷雾离子化质谱(ESI-MS)、二级质谱(MS/MS)和核磁共振(1HNMR)表明,这两种物质在反应体系中形成了复合化合物,即PCH/Fe/TPT复合化合物。由此推测,在FePCH存在的情况下,反应体系中产生的羟自由基距离TPT较近,很容易攻击TPT,造成Sn-C键的断裂而使其分解,从而提高了TPT的分解能力。这是首次检测到该复合化合物的存在,这一发现对环境中有机锡的降解可能会产生积极的影响。