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研究背景:细胞间黏附分子1(ICAM-1)属于免疫球蛋白基因家族成员之一,作用于细胞与细胞间的黏附,可表达于多种细胞表面,其配体是淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和巨噬细胞抗原复合体-1(Mac-1),ICAM-1与其配体的相互作用,在白细胞选择性黏附、游走、抗原递呈和效应T细胞行使功能中起重要作用；在炎症部位,ICAM-1可增强表达于多谱系细胞表面,炎症细胞因子如TNF-α、IFN-γ等可上调和诱导其表达。研究ICAM-1在白细胞细胞的表达情况有助于揭示病程演进中的白细胞选择性黏附分子机理,从不同的角度和层次揭示和阐明免疫细胞、血管内皮细胞和肿瘤细胞等迁移过程中的一些重要分子机理,同时为分子靶治疗提供理论依据。
目的:构建人细胞间黏附分子1(ICAM-1)全长基因的真核表达载体pEGFP-C1-ICAM-1,并转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)细胞株。
方法:采用RT-PCR法从健康人外周血中分离单个核细胞中钓取ICAM-1全长基因(1622bp),与pMD18-T载体连接做全自动序列测定。将测序正确的克隆质粒pMD18-T-ICAM-1和表达载体pEGFP-C1分别用HindⅢ和Ⅰ进行双酶切,应用基因重组技术构建ICAM-1全长基因真核表达载体pEGFP-C1-ICAM-1,质粒经HindⅢ和SacⅡ双酶切和PCR电泳鉴定后,采用脂质体转染法转染CHO细胞,G418筛选。ICAM-1_GFP/CHO细胞能连接PMA处理的Molt-4细胞。
结果:重组质粒经限制性酶切鉴定得到与ICAM-1全长基因长度一致(1622bp)的酶切产物；测序分析证实,PCR产物与GenBank上登录的ICAM-1基因(NM_000201)序列完全一致,表明成功地完成了ICAM-1的扩增和表达载体的构建；荧光显微镜下可见转染的CHO细胞有绿色荧光蛋白的表达,表达的融合蛋白较均匀的分布于整个细胞,FACS检测ICAM-1_GFP的荧光转染率为(13±5.5)％,表明ICAM-1_GFP基因进入到CHO细胞并获得了有效表达,成功构建了ICAM-1_GFP/CHO细胞,并且ICAM-1_GFP/CHO细胞能够连接PMA处理的Molt-4细胞。
结论:本研究通过构建带有ICAM-1_GFP功能基因增强型绿色荧光蛋白表达载体,构建完成真核表达载体ICAM-1_GFP基因在CHO细胞内成功表达,为进一步研究ICAM-1分子的功能打下基础。