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MicroRNA（miRNA）作为一类重要的生物标志物,广泛存在于动植物体内。研究表明,miRNA的异常表达与多种疾病存在密切联系,因此miRNA的表达水平可以作为疾病诊断的可靠依据,这使得大量的科研工作者投身于miRNA的检测之中。近年来,随着纳米科技的快速发展,基于纳米颗粒的miRNA检测技术已经成为面向临床诊断的研发热点。然而,当前基于纳米技术的检测手段大多依赖于纳米材料所特有的某一类性质,如光、电、磁等特殊性质。一些具有特殊性能的纳米材料通常需要通过复杂的制备过程获得并需要较为复杂的表面修饰,这在很大程度上限制了这些检测方法的通用性。纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）是一种直接、实时可视化分析均相溶液中纳米颗粒粒径和浓度信息的新兴技术。该技术可以在不借助纳米颗粒特定性能的前提下实现对纳米颗粒的精准计数。本文首次系统的建立了基于NTA技术的miRNA检测模式,通过将miRNA含量与纳米颗粒浓度建立定量关系,开发了通用性强、操作简便,并且能够满足实际检测需求的miRNA分析方法。本文的具体研究内容如下:本文第2章中,我们对基于NTA的miRNA检测方法进行了一系列摸索,对实验中的影响因素进行了深入探究。我们计划建立单个功能核酸分子标记的金纳米颗粒（gold nanoparticles,GNPs）浓度与miRNA含量的数量关系,并借助酶循环剪切进行信号放大,通过NTA对GNPs的计数实现miRNA定量分析的新策略。首先,我们对GNPs表面单个功能核酸的标记进行了探究,提出了调节功能核酸与封闭DNA的用量比例来实现在GNPs表面实现单个核酸分子标记的方案,但实验结果表明该方案不能实现GNPs的功能化。经分析,该方案未能实现主要是由功能核酸探针浓度较低,使反应在动力学上难以进行并且很难保证所有金纳米颗粒都被标记所导致的。因此我们将设计中单个功能核酸分子标记GNPs的方案改为使用多个功能核酸分子修饰GNPs。之后,我们对实验中涉及的酶循环剪切反应过程做了进一步探究,实验结果表明双链特异性核酸酶（duplex-specific nuclease,DSN）在GNPs表面不能进行循环剪切。经过分析,我们认为DSN难以接近GNPs表面功能核酸、封闭DNA产生的空间位阻、加热时GNPs表面核酸脱落、以及GNPs本身对酶活性的抑制可能是造成DSN不能在GNPs表面进行循环剪切的主要原因。为解决这一问题,我们调整了实验策略,在均相溶液中进行酶循环剪切反应之后再令其产物与功能化GNPs上的核酸探针杂交,然后进行后续反应并对miRNA进行定量分析。验证实验表明,新的实验设计可以实现对miRNA的定量检测。最终,我们探索了一种可行的基于NTA的miRNA检测方法。本文第3章中,在前一部分的系列探索基础之上,我们建立了一种基于NTA结合酶循环剪切信号放大技术的miRNA多重检测新策略。在此项工作中,我们设计了Probe 1和Probe 2两种DNA探针。Probe 1在5’端修饰有生物素,其靠近5’端的序列可以与目标miRNA杂交,靠近3’端部分可以与修饰在GNPs表面的Probe 2杂交。Probe 1与目标miRNA杂交后,DSN识别并选择性地切割Probe 1中与目标miRNA杂交的序列,由此释放miRNA进行下一轮杂交和切割反应,而Probe 1残余的3’端序列将在GNPs表面与Probe 2杂交。这样,Probe 1的5’端修饰的生物素分子就不会被引入到GNPs表面。反之,当体系中不存在目标microRNA时,Probe 1不会被DSN识别和切割,这样,Probe 1的3’端序列与Probe 2杂交后将生物素将引入到GNPs表面。向反应体系中加入链霉亲和素修饰的磁性微球（streptavidin-functionalized magnetic beads,STV-MBs）后,表面带有生物素的GNPs将被捕获和分离。因此,在该设计中GNPs相对于空白对照样品的数量变化与目标miRNA浓度呈正相关。此外,利用NTA平台内置软件在颗粒分群上的优势,该方法可以实现对多种miRNA的同时检测。通过系统的方案设计和实验优化,本文建立了纳米颗粒与目标miRNA之间的定量关系,并通过NTA绝对计数和颗粒分群实现了不依赖于纳米颗粒任何特殊性质的miRNA精准定量分析,为通用型核酸检测方法的建立和NTA在临床检测中的应用提供了新的思路。