碳量子点对人骨肉瘤143B细胞的凋亡作用及其机制研究

来源 :北京大学医学部 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liaonianyou
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[目的]目前大多数恶性肿瘤最有效的治疗方法为外科手术和化疗,但是因为肿瘤的耐药变异和早期诊断率较低,所以导致恶性肿瘤死亡率很高。在骨科骨肉瘤是一种常见的原发性肿瘤,其恶性程度高、预后极差,目前的治疗方案都有一定的副作用、缺陷和不足。而纳米科学技术是正在崛起的新科技,纳米材料的抗肿瘤性也是近年来生物医学研究的热点。纳米碳材料(Carbon-based Nanomaterials)较其他纳米材料有众多优势,成为目前纳米材料的“新星”。碳量子点(Carbon Quantum Dots,CQDs)作为纳米碳材料中的一员,相较于其他纳米碳材料除了具有如肿瘤诊疗、生物成像性、抗菌抗病毒性等生物学效应外,还具有荧光性强、水溶性好、稳定性高、毒性低、制备方法简单、表面易修饰等特性。虽然目前针对碳量子点抗肿瘤作用的研究很多,但是目前关于其对骨肉瘤治疗的相关研究较少,对骨肉瘤治疗的详细分子生物学机制尚不清楚,还需要进一步研究。因此,本研究选取恶性程度较高的人骨肉瘤143B细胞系进行体外细胞实验及建立荷瘤裸鼠模型进行体内动物实验,旨在对碳量子点相关可能存在的抗肿瘤机制进行进一步的研究和探讨。[方法]本研究采用CCK-8、中性红细胞毒性试验及乳酸脱氢酶细胞毒性试验检测人骨肉瘤143B细胞系与高浓度(276μg/ml)、中浓度(138μg/ml)、低浓度(69μg/ml)CQDs共培养24h、48h及72h后细胞形态以及细胞毒性;采用Annexin V-FITC/PI双染流式法检测CQDs与143B细胞系共培养24h、48h及72h后细胞凋亡情况;利用荧光探针DCFH-DA和JC-10荧光探针检测CQDs与143B细胞系共培养12h、24h及48h后细胞内ROS和MMP变化;应用Western-Blot和免疫荧光(IF)技术测定与碳量子点共培养72h后143B骨肉瘤细胞内相关凋亡蛋白(Bax,Bcl-2,CytochromeC,Caspase-3,Cleaved-Caspase-3,PARP1 和 Cleaved-PARP1)的表达情况。使用健康 4-6 周龄 SPF级雄性NU/NU Nude小鼠皮下注射143B细胞悬液建立荷瘤裸鼠模型,分实验组和对照组2组,实验组每天胃灌CQDs溶胶0.5ml,对照组胃灌等量PBS溶液,每天观察荷瘤裸鼠一般情况,每周测量肿瘤大小变化,4周后处死两组裸鼠解剖肿瘤进行肿瘤大小及重量比较;选取4-6周龄SPF级雄性BALB/c小鼠验证CQDs生物安全性,实验分为两大组:4周组及12周组。每大组内又分为3小组:对照组、低浓度CQDs组(69μg/ml)及高浓度CQDs(276μg/ml)组,低浓度及高浓度CQDs组小鼠通过胃灌0.5ml等量不同浓度CQDs溶胶,对照组小鼠胃灌0.5ml PBS溶液,每天观察小鼠一般情况,每2周称量小鼠体重,4周及12周处死相应组小鼠检测血常规及血生化,解剖小鼠得心、肝、脾、肺、肾、脑,使用HE染色检测胃灌CQDs后小鼠主要器官的组织学变化;使用免疫组化法(IHC)检测小鼠主要免疫器官脾脏肝脏中巨噬细胞(F4/80)淋巴细胞(CD3+,CD4+)表达情况。[结果]CCK-8、中性红细胞毒性试验及乳酸脱氢酶细胞毒性试验结果显示高浓度(276μg/ml)CQDs对人骨肉瘤143B细胞有明显的细胞毒性(P<0.05);Annexin V-FITC/PI双染流式法结果显示高浓度CQDs(276μg/ml)能明显诱导骨肉瘤143B细胞的凋亡(P<0.05);荧光探针DCFH-DA检测结果显示高浓度CQDs(276μg/ml)可明显增加143B细胞内ROS的表达(P<0.05);JC-10荧光探针检测结果显示CQDs(276μg/ml)可以显著降低143B细胞线粒体膜电位的水平(P<0.05);Western-Blot和免疫荧光(IF)结果显示高浓度CQD(276μg/ml)可通过激活143B细胞内线粒体凋亡信号通路,增加凋亡蛋白 Bax、Cytochrome C、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3 和 Cleaved-PARP1的表达(P<0.05),减少细胞凋亡保护蛋白Bcl-2和PARP1的表达从而诱导143B细胞凋亡(P<0.05)。于NU/NUNude小鼠右大腿外侧皮肤注射143B细胞悬液,1月后待肿瘤生长至100mm3成功建立荷瘤裸鼠模型,胃灌高浓度CQDs(276μg/ml)4周后可见实验组荷瘤裸鼠的肿瘤大小明显小于对照组,肿瘤体积抑制率为38.9%(P<0.05),肿瘤重量抑制率为30.1%(P<0.05);正常BALB/c小鼠胃灌高浓度(276μg/ml)及低浓度CQDs(69μg/ml)后体重及血常规指标较对照组无显著性差异(P>0.05),而CQDs组ALT、AST、Cr值均低于对照组,CQDs是否对肝肾功能有保护作用还有待进一步研究。并且显微镜观察心、肝、脾、肺、肾、脑HE染色组织均无局部炎症、增生及坏死。小鼠脾脏中巨噬细胞(F4/80)和淋巴细胞(CD3+,CD4+)表达增高(P<0.01)。[结论]高浓度CQD(276μg/ml)对人骨肉瘤143B细胞有明显的细胞毒性,并且可以通过激活细胞线粒体凋亡信号通路诱导细胞凋亡。对荷瘤裸鼠胃灌高浓度CQDs不仅表现出抗肿瘤作用,而且所有浓度CQDs对正常小鼠均无毒副作用。综上CQDs不仅具有抗肿瘤作用,而且具有较高的生物安全性和生物相容性,作为一种新型的纳米碳材料,CQDs在癌症治疗方面具有巨大的潜力。
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