论文部分内容阅读
食管鳞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)原发于食管鳞状上皮[1],是一种常见的恶性消化道肿瘤,在中国的发病率为全球前五,远高于世界平均水平[2]。由于早期症状不明显,病程进展快,大部分患者确诊时已是中晚期,因此寻找简单有效的早期诊断有助于在疾病发展早期及时确诊,对降低病死率和改善患者预后有重要意义[3-4]。研究发现,核仁小 RNA12(small nucleolar RNA host gene 12,SNHG12)在ESCC组织和细胞株内的表达与正常组织细胞相比上调[5],同时MMP-2蛋白和MMP-9蛋白的表达下调[6],且与下调SNHG12相关[7-9]。若敲低SNHG12能够抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。另外,SNHG12还可以调节内皮细胞的迁移,在细胞的增殖和迁移中发挥重要作用[10]。因此在本研究中,我们筛选出SNHG12表达量最高的两株细胞,用RNAi技术降低SNHG12的表达量,用qRT-PCR技术测定SNHG12在各组细胞中的表达量。流式细胞仪测定SNHG12基因的表达对食管癌细胞凋亡的影响。细胞划痕实验、Transwell实验检测食管癌细胞的转移侵袭能力。最后用Western blot法检测各组细胞中细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2蛋白和Bax蛋白)、浸润转移相关蛋白(MMP2和MMP9)表达量的变化。目的探讨SNHG12在食管鳞癌发生发展中的调控作用,为治疗食管鳞癌寻找一个新的潜在靶点。方法(1)食管鳞癌中SNHG12表达的检测:qRT-PCR技术检测不同食管鳞癌细胞株中SNHG12基因的表达,筛选出表达量最高的两株细胞用于后续研究。用正常食管上皮细胞作为对照。(2)siRNA 转染:将 NC siRNA 和三条 SNHG12 siRNA 用 lipo2000 分别转染上述两株细胞,根据qRT-PCR结果分析转染效果。(3)细胞增殖检测:将每株细胞分为三组,其中一组中转入siRNA后,继续培养Oh、24h、48h和72h,用CCK-8法测定细胞增殖率。(4)细胞凋亡检测:用PIPC试剂盒分别处理SNHG12 si组和NC组细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡,并分别计算得出三组细胞的凋亡率,观察SNHG12对食管鳞癌细胞凋亡的影响。(5)细胞迁移检测:细胞划痕实验和Transwell实验分别测定了三组细胞在相同条件下的迁移和侵袭能力的改变。(6)机制探讨:用Western-blotting实验检测两组细胞中的Bcl-2和Bax凋亡相关蛋白和MMP2、MMP9浸润转移相关蛋白在转染前后的变化。(7)统计学处理:应用Graphpad软件对数据进行统计学处理,组间比较采用x2检验,每组数据用均数±标准差(x±s)表示,多个样本均数比较用单因素方差(one-way ANOVA)进行分析,检验水准为α=0.05。结果(1)qRT-PCR结果显示不同食管鳞癌细胞和正常食管上皮细胞中的SNHG12表达量差异显著,尤其是KYSE450细胞、KYSE180细胞的表达量最高,因此选择二者进行后续研究。(2)SNHG12 siRNA转染之后,与各自的siRNA组和NC组相比,两株细胞中siRNA组的SNHG12基因的表达量都显著降低,且SNHG12-homo-354在三条siRNA序列中敲低效果最显著,因此选用此条序列进行后续干扰RNA实验。(3)CCK-8细胞增殖实验的结果显示,细胞在转染48h内增殖率明显低于NC组,且分别在48h和72h都持续下降。说明敲低SNHG12的表达可以有效抑制细胞增殖。(4)细胞凋亡结果显示,在转染48h后,KYSE450和KYSE180细胞中siRNA组的早期凋亡细胞数分别占总细胞数的7.3%和1.2%,显著高于对照组和空白组。且差异具有统计学意义(P<0.01)。另外,两株细胞中NC组的活细胞数分别是96.4%(KYSE450)和86.1%(KYSE180),显著高于siRNA组的活细胞数(KYSE450:50.3%和 KYSE180:9.9%),差异具有统计学意义(P<0.01)。(5)KYSE450的细胞划痕实验结果表明,转染48h后si组与空白组和NC组相比,两株细胞的迁移明显受到抑制,其差异具有统计学意义(P<0.01)。KYSE180的细胞划痕实验也做同样比较发现其差异具有统计学意义(P<0.01)。而两株细胞的空白组与NC组相比,细胞的迁移距离差异无统计学意义。(6)Transwell实验结果显示,KYSE450细胞中的si组细胞的穿膜细胞平均数为221.3,显著低于空白组(389.1)和对照组(395.5)细胞的穿膜数。KYSE180细胞中的si组细胞的穿膜细胞平均数为97.3个/每个视野内,显著低于空白组(147/每个视野内)和对照组(152.6个/每个视野内)。(7)Western-blotting结果显示,KYSE450和KYSE180的si组与空白对照组相比Bcl-2蛋白表达量都显著降低,其差异具有统计学意义(均P<0.01)。而Bax蛋白的表达水平在两株细胞中的si组中的表达量明显高于NC组,其差异具有统计学意义(均P<0.01)。结论(1)SNHG12可能参与调控了食管鳞癌的发生、发展、侵袭和转移过程。(2)SNHG12基因的表达下调与Bcl-2蛋白、Bax蛋白,MMP2蛋白和MMP9蛋白的表达相关。