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肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，具有发病隐匿、恶性程度高、进展快、侵袭转移性强、预后差等特点。手术切除是HCC治疗的主要手段，但术后复发及转移极大影响了肝癌治疗后的远期疗效。近期研究显示n-3多不饱和脂肪酸（n-3polyunsaturated fatty acids，PUFAs）能够抑制肿瘤的发生和转移，增强肿瘤细胞的药物敏感性，然而机制尚不清楚。二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）是深海鱼油和海洋微藻中存在的n-3PUFAs，是生物体的重要组成成分，其具有抗炎、防治心血管疾病、缓解各种代谢性疾病及抗肿瘤作用。研究指出，DHA通过脂质过氧化和氧化应激，提高肿瘤细胞的细胞毒作用，还可以通过刺激产生线粒体ROS，使肿瘤细胞自噬。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指具有极性的上皮细胞失去细胞间粘附能力转变成具有侵袭和迁移能力的间质细胞的过程，是肿瘤转移的重要机制之一。EMT过程中，细胞形态由铺路石形转变为有侵袭性的长梭纺锤形，同时伴有其上皮标志蛋白下调（E-cadherin、α-catenin），间质标志蛋白上调（N-cadherin、vimentin、fibronectin）。多种自分泌因子、转录因子、microRNAs以及TGF-β、Wnt/β-catenin、Notch等通路作为重要因素影响EMT。近期研究表明CD147也参与了HCC中EMT的发生。CD147是一种高度糖基化的细胞膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族类黏附分子，该分子高表达于上皮来源的肿瘤细胞中，参与肿瘤细胞的侵袭和转移过程。CD147的过表达可促进肿瘤细胞本身及其周围的成纤维细胞和内皮细胞分泌MMPs降解细胞外基质，也可诱导HCC中EMT的发生促进肿瘤细胞侵袭。本课题的研究目的：DHA对细胞增殖和凋亡的影响；DHA是否逆转SMMC-7721细胞EMT； DHA是否通过逆转EMT抑制细胞的迁移和侵袭；明确CD147在DHA逆转EMT中的作用。第一部分：DHA对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响不同浓度DHA（0、10、20、50、100、200、300、400μM）分别干预SMMC-7721细胞24、48、72h后，用MTT法测定DHA对细胞存活能力的影响；流式细胞术检测细胞凋亡情况。1．在DHA浓度≤100μM范围内，作用时间为48h时，100μM组与阴性对照组相比，明显抑制细胞增殖，差异有统计学意义（P <0.05）。此作用条件范围内的其它实验组与阴性对照组相比，细胞存活率均无显著性影响；当DHA作用浓度≥200μM且作用24、48、72h后，实验组与阴性对照组相比，细胞存活率显著降低（P <0.05）。2．DHA（0、20、50、100、200μM）作用SMMC-7721细胞48h后，其凋亡比例随DHA作用浓度的增大而增加（P <0.05）。结论：低浓度DHA短时间作用细胞无明显抑增殖作用，而高浓度DHA长时间作用后，能显著抑制SMMC-7721细胞存活率并诱导其凋亡。第二部分：DHA对SMMC-7721细胞EMT的影响不同浓度DHA分别干预SMMC-7721细胞8、16、24、48h后，镜下观察细胞形态学的改变；利用Western Blot法检测EMT标志蛋白（E-cadherin和N-cadherin）的表达。1．镜下观察细胞形态由长梭形或纺锤形转变为规则的铺路石样，呈现逆转EMT的形态变化2．实验组与对照组相比，细胞经DHA处理8、16h后，E-cadherin的表达量随DHA作用浓度和时间的增加而增多。3．DHA分别作用细胞8、16、24、48h后，N-cadherin的表达量随DHA作用剂量的升高而降低。结论：DHA能够逆转SMMC-7721细胞的EMT过程。第三部分：DHA对SMMC-7721细胞迁移和侵袭能力的影响不同浓度DHA分别干预SMMC-7721细胞24、48、72h后，划痕实验评价DHA对细胞迁移能力的影响；Transwell实验评价DHA对细胞侵袭能力的影响。1．同一时间点，不同浓度组（20、50、100、200μM）分别与对照组比较，细胞迁移率显著降低（P <0.05），迁移率随DHA浓度的增大而减小。2．同一时间点，不同浓度组（20、50、100、200μM）的细胞侵袭能力与对照组相比显著降低（P <0.05），细胞侵袭数量随DHA浓度的增大而减少。结论：DHA通过逆转SMMC-7721细胞EMT过程显著抑制其迁移和侵袭能力。第四部分：DHA调控SMMC-7721细胞EMT的机制不同浓度DHA分别干预SMMC-7721细胞8、16、24、48h后，Western Blot法和Real-Time PCR分别检测CD147及其mRNA水平。1．在DHA作用SMMC-7721细胞8、16h后，CD147蛋白表达无明显差异，而作用24、48h后，CD147蛋白的表达量随DHA作用时间的增加而降低，也随DHA作用剂量的升高而降低。2．Real-Time PCR检测发现，8h组50、100、200μM的CD147转录水平，16h和24h组20、50、100、200μM的CD147转录水平与对照组相比显著降低（P <0.05）。结论：DHA抑制CD147蛋白及其mRNA的表达，CD147可能是逆转EMT的潜在分子。