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前言 转化生长因子β（Transforming growth factor,TGF-β）是一类多功能的多肽类生长因子，几乎体内的每个细胞都产生TGF-β并存在其受体。TGF-β1作为TGF-β的一个重要亚型，同时也是人体内主要的存在形式，早在20世纪80年代就已被证实在细胞的增殖与分化、细胞外基质（ECM）的合成与沉淀、血管的生成及细胞凋亡中起重要作用。在肿瘤的发生发展过程中，TGF-β1具有双相作用：在肿瘤发生早期，抑制肿瘤细胞的生长；随着肿瘤的发展，它变成了肿瘤生长的刺激因子。近年来，随着人们对其研究的不断深入，发现TGF-β1作为一类具有多种生物学活性的多效细胞因子，在肿瘤的发生发展、浸润和转移中均起着非常重要的作用。但是，目前国内外的研究很少涉及TGF-β1在食管鳞癌组织中的表达与病理分级、临床分期、肿瘤浸润深度、淋巴转移的关系。本研究将就对此问题进行相关探讨。 实验材料 1．材料：收集2001年9月—2002年3月中国医科大学附属第一医院和辽宁省肿瘤医院胸外科食管癌标本共45例，其中包括癌组织及癌旁6cm以上的正常组织，手术切除后于-80℃深低温冰箱冻存。所有病例术前均未发现有远处转移，未行放疗、化疗，术后均有病理证实。45例病例中男性34例，女性11例；小于60岁的31例，大于等于60岁的14例，平均年龄53.2岁（范围36-73岁）；均为鳞癌；TNM分期Ⅰ期9例，Ⅱ期22例，Ⅲ期11例，Ⅳ期3例；其中18例有淋巴结转移。分期标准依照国际抗癌联盟（UICC厂997年 10月出版的第 5版《恶性肿瘤 TNM分期》中的食管癌标准划分。 2．试齐IJ：RNA提取试剂 TRIZOI 购自 GIBCO BRL公司；TAKA－M RNA KIT（AMV）VZ．1购自宝生物（大连）工程有限公司Z RT－PCR弓物由上海 SANGON生物工程公司合成；PGEM－3ZF（＋）DNA／HAV皿 MAKERS购自华美生物工程公司；其他试剂均为国产分析纯化。 3．主要仪器设备：超声粉碎机＊PS－1型，上海超声波仪器厂）；台式高速低温高心机（DUPONT SUPER－2型，美国 SOR－VALL公司）紫外分光光度计(UV－260型，日本SHIMADZU公司厂多功能电泳仪（MULTIPHOR fi型，瑞典PHARMACIA BIO－TECH公司）； BIOMETRA UNIO 11型 PCR仪（德国）；凝胶自动成象及分析系统(UPV，US幻。 实 验 方法 1．总mRNA提取：各切取100毫克食管癌组织及癌旁正常组织，加入 lml TRIZOI试剂，用匀浆器将组织匀浆，加人 0．Zml氯仿充分振荡 15秒，4℃10，000rpm离心 15分钟，取上清，加人 75％乙醇(DEPC处理水配制V，涡旋漂洗一次，4℃7500rpm离心 5分钟，弃上清，将沉淀溶于 0．01％DEPC水，置于 55－60℃水浴中孵育 10分钟，于分光光度计下测定 RNA浓度，用 0．of％DEPC水调整 RNA终浓度为 illyl，然后置于一80℃深低温冰箱中保存。 2．反转录及代R扩增：反转录体系如下：适量总RNA加人OligO dT引物，于70℃孵育10分钟，立即置于冰上静置5分钟，再加人 ltils x buffer刀．sul dNTP刀．25ul RNA酶抑制剂，于 37℃孵育5分钟，加人0．sul AMV，并以 DEPC处理的水，补足sill体系，37℃孵育50分钟，再于95℃加热5分钟，灭活AMV。 ·2· 在此基础之上进行PCR扩增，PCR反应体系如下：取RT产物sill，依次加人 10 x buffer Zal、TGF ＊；上＼下游引物各 0．sal、TaqE 0．Zul，用 ddH对补足反应体系共25ill。然后送 PCR仪上扩增。PCR反应条件为：95℃变性2分钟，按94℃二分钟，55℃互分钟，72℃l分30秒循环30个周期，再于72℃延伸7分钟。TGF一民CDNA的引物，根据TGF一民基因结构，选择扩增CDNA的碱基序歹。上游引物为：5’－GCCCTGGACACCAACTArITGCT－3’；下游弓物为：5’一AGGCTCCAAATGTAGGGGCAGG－3’，预计扩增片段为161hp；内部参照p－actin引物序列上游引物为：5’－GT－GGGCCGGTGTAGGCACCA－3’；下游引物为：5’－GG’ITGGCCT－TAGGGryCAGG－3’，预计扩增片段为246hp。 3．PCR产物（聚丙烯酸胺凝胶电泳检测）取10 llPCR产物进行 12％聚丙烯酸胺凝胶电泳，进行澳乙锭染色（终浓度 0．5 fig／l）凝胶经UVP凝胶成像分析系统进行扫描分析。TGF一民 mR－NA相对表达水平计算公式如下：某样品 TGF一民 mRNA相对表达水平一样品TGF一民扫描值／样品B－actin扫描值。 4．统计分析：检测结果以R对表示，组间比较采用t检验。 实验结果 1．不同组织中TGF一民mRNA水平：在45例食管鳞癌标本中，各期食管癌组织中TGF一民mRNA水平均显著高于癌旁正常组织瞩＜O．01X而随着病理分期1期到w期＊＊F一民m＊＊A水平逐渐增高评＜0．01人 人TGF一民 mRNA水平与食管癌临床病理的关系：不同组织分化程度的食管癌组织中的TGF－p；mRNA水平无显著差异河＞0．01人在肿瘤细胞局部浸润深度中，（Ts＋T．）组食管癌组织中的 TGF－＊ mRNA水平显著高于（T；＋Ti）组（P＜0．of）。有淋