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糖尿病视网膜病变是糖尿病最常见的微血管病变之一,是工作年龄成人致盲的主要原因。氧化应激在糖尿病视网膜病变的发生中起重要作用,是由于活性氧生成和清除不平衡的结果。谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase, GST)是一组普遍存在于各种生物体内的Ⅱ相代谢酶,在包括环境致癌物、化疗药物、活性氧等许多内源性和外源性物质的代谢和解毒方面起重要作用。研究得最多的谷胱甘肽硫转移酶多态性包括GSTM1基因缺失多态性、GSTT1基因缺失多态性和GSTP1基因Ile105Val多态性。GSTM1和GSTT1基因的纯合缺失则失去各自酶的活性。GSTP1基因Ile105Val多态性是在313位的1个A到G的转换,对应蛋白质的105位氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸,酶活性降低。GSTA1也是重要的谷胱甘肽硫转移酶之一,在肝脏的含量最多。在GSTA1基因的启动子区有3个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),组合在一起产生两种变异:GSTA1*A(-567T,-69C,-52G)和 GSTA1*B(-567G,-69T,-52A)。具有GSTA1*B的个体的GSTA1在肝脏表达降低。因为这3个SNP位点紧密连锁,对-69位点的酶切分型即可区分GSTA1*A和GSTA1*B。GSTM1基因、GSTT1基因、GSTP1基因、GSTA1基因的缺失基因型或低活性基因型与血液透析患者和癌症患者的氧化损伤相关。NQO1是1种能还原活性氧的蛋白质,从而能保护细胞。NQO1的活性与其多态性密切相关。位于NQO1 cDNA609位核苷酸的C到T替换使其对应蛋白质的187位氨基酸由脯氨酸转变为丝氨酸,显著降低酶的活性。对GSTM1和GSTT1基因缺失多态性、GSTP1基因Ile105Val多态性、GSTA1基因C-69T多态性和NQO1基因C609T多态性的研究主要集中在肿瘤方面。关于这5个多态性与糖尿病视网膜病变的研究不多,得到的结果也不一致。目前,还没有GSTA1基因C-69T多态性和NQO1基因C609T多态性与糖尿病视网膜病变之间关系的报道。在我国还没有这5个多态性位点与糖尿病视网膜病变之间关系研究的报道。 为了更好地理解GSTM1, GSTT1, GSTP1, GSTA1和 NQO1在我国2型糖尿病视网膜病变形成中的作用,我们开展了本研究。此外,考虑到GSTT1和GSTM1基因缺失多态性、GSTP1基因Ile105Val多态性通常是一起被研究,而它们又是用不同的方法分别研究,有必要建立1种简单、可靠的方法来同时对这3个多态性进行检测。 目的: 1、建立一种简单、可靠的能同时检测GSTM1和GSTT1基因缺失多态性、GSTP1基因Ile105Val多态性的方法。 2、研究GSTM1和GSTT1基因缺失多态性、GSTP1基因Ile105Val多态性GSTA1基因C-69T多态性和NQO1基因C609T多态性与糖尿病视网膜病变之间的关系。 方法: 1、建立同时检测GSTM1和GSTT1基因缺失多态性、GSTP1基因Ile105Val多态性的方法时用了259例志愿者。首先从全血里提取了基因组DNA并稀释为10ng/μl。接下来是建立GSTP1基因Ile105Val多态性四引物扩增受阻突变体系PCR检测的方法,最后在GSTP1基因Ile105Val多态性四引物扩增受阻突变体系PCR的基础上对多重PCR同时检测GSTM1和GSTT1基因缺失多态性、GSTP1基因Ile105Val多态性的条件进行优化。用GSTM1和GSTT1基因缺失多态性多重PCR法和GSTP1基因Ile105Val多态性的测序法对多重PCR同时检测GSTM1和GSTT1基因缺失多态性、GSTP1基因Ile105Val多态性的结果进行验证。 2、在研究GSTM1和GSTT1基因缺失多态性、GSTP1基因Ile105Val多态性、GSTA1基因C-69T多态性和NQO1基因C609T多态性与糖尿病视网膜病变之间的关系时用了546例2型糖尿病样本。病人全部来自南昌大学第一附属医院内分泌科。根据眼底检查的结果把病人分成2组:糖尿病视网膜病变组(DR组),包括85名男性和73名女性,平均年龄58.34±10.64岁,有糖尿病但没有视网膜病变组(NDR组),包括216名男性和172名女性,平均年龄60.08±11.45岁。所有患者都是无亲属关系的汉族人。测量身高、体重、血压,计算体重指数。检测并记录患者的空腹血糖、餐后2小时血糖、糖化血红蛋白、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、尿素氮、肌酐、尿酸水平。记录糖尿病病程。GSTM1和GSTT1基因缺失多态性、GSTP1基因Ile105Val多态性的检测用多重PCR的方法。GSTA1基因C-69T多态性和NQO1基因C609T多态性的检测用构象差异凝胶电泳的方法。所有多态性的分型结果用其他的分型方法进行验证以保证结果的准确性。Hardy-Weinberg平衡检验采用?2检验。比较5个多态性各基因型在DR组和NDR组的分布情况。比较DR组和NDR组的临床资料之间的差异。单变量分析显示有差异的变量进行logisitic回归分析DR的危险因素。实验数据用SPSS20.0软件进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义。 结果: 1、在GSTP1基因Ile105Val多态性四引物扩增受阻突变体系PCR的基础上,建立了单管多重PCR同时检测GSTM1和GSTT1基因缺失多态性、GSTP1基因Ile105Val多态性的方法。该方法可以降低检测成本,缩短检测时间。该多重PCR对GSTM1和GSTT1基因缺失多态性、GSTP1基因Ile105Val多态性的分型结果分别与GSTM1和GSTT1基因缺失多态性多重PCR的检测结果和GSTP1基因Ile105Val多态性的DNA测序结果一致。 2、5个多态性的分型结果清楚,与确认的分型方法结果一致。GSTP1基因Ile105Val多态性、GSTA1基因C-69T多态性和NQO1基因C609T多态性的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。统计学分析显示GSTM1和GSTT1基因缺失多态性、GSTP1基因Ile105Val多态性、GSTA1基因 C-69T多态性和NQO1基因C609T多态性与糖尿病视网膜病变的发生均无关,P值分别为0.822、0.449、0.639、0.561和0.713。临床资料分析显示糖尿病病程在DR组更长,尿素氮、肌酐和尿酸水平在DR组更高。非条件logisitic回归分析显示糖尿病病程和血尿素氮水平是DR的独立危险因素。 结论: 1、基于GSTP1基因Ile105Val多态性四引物扩增受阻突变体系PCR的单管多重PCR法是一个准确、简单、快速和低成本的同时检测GSTM1和GSTT1基因缺失多态性、GSTP1基因Ile105Val多态性的方法。 2、GSTM1和GSTT1基因缺失多态性、GSTP1基因Ile105Val多态性、GSTA1基因C-69T多态性和NQO1基因C609T多态性与我国江西汉族2型糖尿病视网膜病变的发生无关。