【摘 要】
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在真核细胞的生命周期中,有丝分裂是最基础也最为重要的进程.尽管已经对磷酸化蛋白在M期(有丝分裂和减数分裂)启动及进程方面的重要作用进行了细致的研究,但对其机制仍知之甚
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在真核细胞的生命周期中,有丝分裂是最基础也最为重要的进程.尽管已经对磷酸化蛋白在M期(有丝分裂和减数分裂)启动及进程方面的重要作用进行了细致的研究,但对其机制仍知之甚少.众所周知,蛋白质的磷酸化是调节多种细胞进程,尤其是有丝分裂期进程的普遍机制.在有丝分裂期,核膜蛋白的磷酸化直接参与核膜的崩解,并且,组氨酸及波形蛋白的磷酸化也可能分别参与染色体的凝聚和中间丝的重排.因此研究、鉴定有丝分裂期的磷酸化蛋白对深入了解有丝分裂期进程是极为重要的.MPM-2单克隆抗体,一个抗磷酸蛋白抗体,由有丝分裂期Hela细胞抽提物制备而来.相对于间期,该抗体以磷酸化依赖性的方式识别一大类有丝分裂期磷酸化蛋白.由于该类蛋白在间期合成,在有丝分裂期磷酸化(MPM-2反应性),且许多MPM-2磷蛋白存在于有丝分裂装置上,因此MPM-2磷酸化蛋白一定在有丝分裂进程中发挥重要的作用.本研究选用人上皮样喉癌细胞株HEp-2为细胞模型,对该细胞抽提物进行单、双向电泳,免疫印迹及质谱鉴定,确定了几种MPM-2磷酸蛋白.我们对其中一个表观分子量为80kDa、在双向电泳凝胶上被分离出几个高度酸性蛋白组分的蛋白进行了进一步的研究,并确定该蛋白为真核细胞起始翻译因子eIF4B.已知eIF4B是一个RNA结合蛋白,在起始翻译的过程中参与多个相互作用.近十年间,已有许多eIF4B功能方面的研究报道,如它可以激活eIF4A的RNA螺旋酶活性、可以与18S rRNA结合,还可以与核糖体结合的eIF3的相互作用以及在起始密码子处增强mRNA-rRNA-tRNA之间的相互作用等.但是,过去的研究认为,在体外,eIF4B并非为起始复合体形成所必需.eIF4B,已被鉴定为一种磷酸化蛋白,其磷酸化位点与其翻译活性相关.在哺乳动物中,热激,血清饥饿,有丝分裂以及某些与翻译水平降低相关的事件都会引起eIF4B去磷酸化.而且,哺乳动物磷酸化的eIF4B还能够部分地的修复翻译.本论文的目的是使用细胞免疫学方法首先检测HEp-2细胞中MPM-2磷酸蛋白的分布;其次除运用细胞免疫学方法之外,充分使用我细胞所先进的设备资源,运用双向电泳及质谱技术鉴定MPM-2磷酸蛋白.为更深入地进行MPM-2磷蛋白对有丝分裂期进程的调控研究打下基础.
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