【摘 要】
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(一)随着模式生物和其它物种基因组全序列测序的完成,揭示基因的功能显得日益重要,而基因表达则是研究基因功能不可或缺的手段.1、构建线性表达载体研究基因的表达利用杂交引
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(一)随着模式生物和其它物种基因组全序列测序的完成,揭示基因的功能显得日益重要,而基因表达则是研究基因功能不可或缺的手段.1、构建线性表达载体研究基因的表达利用杂交引物、非对称限制性内切酶和切口酶N.Bpu 10I结合核酸外切酶Ⅲ的方法构建线性表达载体,转染哺乳动物细胞,并观察绿色荧光蛋白的表达.2、构建穿梭表达载体(pShutter)研究基因的表达pShutter载体利用强启动子CMV实现基因在哺乳动物细胞中的表达,利用T7/lac杂交启动子在原核细胞中进行严谨调控,同时整合了V5亲和标签,6×His纯化标签和GFP-Blasticidin抗性筛选标记.它可以直接克隆PCR产物、方便地检测和纯化蛋白,只需通过荧光即可监测细胞转染效率,而且该载体可用于快速筛选稳定的细胞克隆.(二)对于研究某个基因,可以对其进行一定的改造后,根据蛋白质表达水平或生物学活性的变化来研究它的功能,基因定点突变技术无疑为改造基因提供了有力的工具.1、利用体外转录、DNaseⅠ消化和反转录PCR实现高效率DNA突变将T7启动子序列和ⅡS型限制性酶切位点引入突变引物的5端,通过PCR扩增产生突变体DNA用于体外转录,合成RNA;利用DNase Ⅰ完全降解模板DNA和突变体DNA后;RNA用作模板经反转录PCR产生突变的双链cDNA,后者再用限制性酶切割消化去掉T7启动子和ⅡS型限制性内切酶识别序列.2、利用T4 DNA聚合酶和DpnⅠ限制性内切酶实现DNA突变该方法利用一条突变引物和一条通用引物来合成突变体DNA.质粒模板变性后和突变引物退火,在T4 DNA聚合酶作用下合成第一条突变链;反应混合物经第二次变性,通用引物和新合成的链退火,T4 DNA聚合酶催化再合成另一条突变链.之后利用Dpn I降解模板DNA和半甲基化DNA,终产物转化大肠杆菌.
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