【摘 要】
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本实验室先前的分子克隆工作发现GABA受体存在于大鼠睾丸中,得 各个亚基的部分片段,为获得亚基的全长序列,我们进行了RACE PCR,在对β3亚基的5RACE产物分析时,发现了一种新型拼接变异体,并命名为βi该拼接变异体与神经系统GABA 受体β3亚基的差异在于5端的480bp碱基,包括非编码区和编码区的25个氨基酸.GABA受体β3亚基N端的相应序列被认为是可剪切的信号肽序列,了确定t变异体N端
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本实验室先前的分子克隆工作发现GABA<,A>受体存在于大鼠睾丸中,得 各个亚基的部分片段,为获得亚基的全长序列,我们进行了RACE PCR,在对β3亚基的5RACE产物分析时,发现了一种新型拼接变异体,并命名为βi该拼接变异体与神经系统GABA<,A> 受体β3亚基的差异在于5端的480bp碱基,包括非编码区和编码区的25个氨基酸.GABA<,A>受体β3亚基N端的相应序列被认为是可剪切的信号肽序列,了确定t变异体N端的特异性序列是否也是一种信号肽或有其它不同的功能,我们构建了β 3t-EGFP嵌合体,并在HEK293和CHO细胞中作了异源表达及检测,对该特异性的25氨基酸多肽序列的可能功能进行了分析.当重组质粒β3t-EGFP在HEK293和CHO细胞中表达时呈现两种情况,一种情况是在胞质内均匀或弥散分布,另一种情况是相对集中分布于胞质的某些区域.EGFP则分布于整个细胞中,包括细胞核.flag免疫细胞荧光实验的结果与上述β3t变异体在HEK293细胞表达分布情况是一致的.为了明确β3t变异体是否能够定位到细胞质膜上,我们用大鼠脑GABA<,A>受体β3亚基作为对照,同时使用共聚焦激光显微镜(confocal mi crosj jpe)来观察表达情况,结果观察到大鼠脑β3亚基表达在细胞膜上的绿电荧光,然而新芷的大鼠睾丸β3t变异体仍然分布于胞内,未能定位到细胞膜上.为了探明β3t变异体细胞内的具体分布位置,我们用ConA-Texas-Red(一种内质网标记分子)来标记细胞,结果发现带红色荧光的ConA-Texas-Red与带绿色荧光的β3t变异体位重叠,说明β3t变异体可能定位分布于细胞的内质网上.我们还用Western blot检测了β3t变异体在细胞中的表达情况,结果显示β3t变异体与大鼠脑β3亚基表达产物的分子量大小一致.总之,对大鼠睾丸中发现的不同于神经系统GABA<,A>受体β3亚基的新型拼接变异体β3t的初步研究显示,由于氨基端存在的一段特异性序列(一种可能的内质网滞留信号),使得β3t翻译后不能转运到细胞膜上,并形成功能性受体,而是滞留在了内质网中.我们的发现为了解大鼠睾丸和精子中GABA<,A>受体的合成及转运途径提供了依据,并为研究睾丸和精子中GABA<,A>受体的亚基组成及功能提供了帮助.
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