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手性醇是一类重要的化学中间体，可用于多种小分子药物、农药品和精细化学品的合成。羰基还原酶催化的前手性酮不对称还原，相比于化学催化不对称氢转移反应，具有环境友好、反应条件温和、产物立体选择性高等优点，因此成为最受关注的手性醇制备方法之一。对满足特定过程需求的羰基还原酶的挖掘和开发，也成为生物催化领域的研究热点。本论文以来源于氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）、属于短链醇脱氢酶/还原酶(SDR)超家族的羰基还原酶GoCR为研究对象，对其催化卤代苯乙酮及其他多种前手性酮不对称还原制备相应手性醇的能力进行考察，并借助蛋白结晶和分子模拟等技术，探究其结构-功能关系、酶-底物相互识别与作用模式、底物依赖的立体选择性分子机制，在此基础上对其催化活性、底物特异性、立体选择性等性质进行理性/半理性设计和定向改造。通过多个突变株的构建，成功拓宽了GoCR的催化应用，实现了对已有酶资源催化功能的深度挖掘。主要研究内容包括: 1.野生型GoCR催化卤代苯乙酮不对称还原能力的考察及催化过程研究。以苯环上具有卤素取代的多个苯乙酮衍生物为底物，测试GoCR对其催化活性和立体选择性。结果表明，对于该类底物，GoCR严格遵循Prelog规则，专一生成S-构型醇产物。其中，GoCR催化邻氯苯乙酮比活最高，为1.72 U/mg;催化间氟苯乙酮和对氟苯乙酮比活相对较低，分别为0.14 U/mg和0.09 U/mg。随后，构建异丙醇偶联辅酶再生系统，利用邻位卤素取代苯乙酮还原的准不可逆性(quasi-irreversibility)，添加2.0摩尔当量的共底物异丙醇即实现500 mM邻氯苯乙酮的充分转化(conv.＞95％)，专一生成(S)-1-（2-氯苯基）乙醇。与此同时，构建GoCR-葡萄糖脱氢酶(GDH)串联表达的辅酶再生系统，以解决底物偶联系统辅酶再生速率较低而对整体催化反应造成限制的问题。利用相应重组Escherichia coli BL21全细胞作为催化剂，在12h内实现了647 mM邻氯苯乙酮的完全转化，产物收率81％，纯度98.8％，ee＞99％。此外，利用相同的催化系统亦实现了其他卤代苯乙酮在较高底物浓度(200 mM～400 mM)下的充分转化(conv.=86％～99％)。 2.GoCR晶体结构解析、全酶复合物构建与结构特征分析。通过X-射线衍射技术，获取GoCR apo格式晶体结构。GoCR四级结构由A、B两个同源亚基构成。分子动力学模拟证明，相比于B亚基，A亚基内部存在不合理的亚结构域扭曲，无法代表GoCR的真实结构。以L-2，3-丁二醇脱氢酶晶体结构为模板，构建B亚基的GoCR-NADH全酶复合物结构。GoCR含有典型的Rossman折叠，其催化四联体为Asn113-Ser142-Tyr155-Lys159，并通过与辅酶和水分子形成氢键网络来构成质子传递系统。两个短α螺旋组成的lobe区（残基190-220）和一段loop区（残基185-190）则共同构成GoCR的疏水性底物结合口袋。 3.基于结构的半理性设计和改造，提高GoCR催化卤代苯乙酮的活性。针对野生型GoCR催化间氟苯乙酮、对氟苯乙酮等底物活性较低的问题，借助分子对接和结合自由能计算，预测Trp193和Ile187两个残基是影响其比活的关键位点。随后，构建高质量的半饱和突变库。酶活测定表明，相比于野生型，单点突变株W193F将间位取代苯乙酮比活提高了7.26-～12.29倍，突变株I187P则分别将间氟苯乙酮和对氟苯乙酮比活提高了17.10和7.56倍。利用I187P-GDH串联表达的Ecoli BL21全细胞作为催化剂，考察突变株催化400mM间氟苯乙酮和300mM对氟苯乙酮转化的能力。结果表明，和野生型相比，突变株转化率分别提高了20％和11％，且立体选择性未发生改变。此外，通过序列和结构分析，发现Trp193和Ile187位点在SDR超家族羰基还原酶中存在较为普遍，且两个残基的空间位置和相对位置均与GoCR类似。说明本研究中提出的这两个位点对其他羰基还原酶的活性改造具有一定的借鉴意义。 4.GoCR底物特异性的计算机辅助设计与改造。野生型GoCR无法有效催化羰基碳上具有较大取代基团的底物，如3，5-双三氟甲基苯乙酮（BTAP，其不对称还原产物是合成NK-1受体拮抗剂的关键前体）。以BTAP为模式底物，结合分子对接和分子动力学模拟，分析酶-底物识别和结合模式，预测阻碍底物靠近催化残基、影响底物结合的关键位点，通过逐步突变，筛选到酶活显著提高的三点突变株W193A/I143A/Y149L和W193A/I143A/I187P，将催化BTAP比活从0分别提高到0.79 U/mg和0.91U/mg。利用重组W193A/I143A/I187P E.coli BL21作为催化剂，实现了1000 mM BTAP的完全转化，产物(S)-3，5-双三氟甲基苯乙醇(S-BTPE)分析得率94％，ee＞99％。此外，以单点突变株W193A为靶标，基于Vina软件对其潜在底物进行虚拟筛选。最终，从130个具有较大体积的羰基化合物中筛选到64个潜在底物。选取4个底物进行实验验证，结果表明，对于其中的2个联芳酮化合物3-乙酰联苯和4-乙酰基-4'-溴代联苯，W193A都表现出了相比于野生型显著提高的催化效率。 5.GoCR底物依赖的立体选择性分子机制研究及其立体选择性改造。结合分子对接和分子动力学模拟，证明GoCR底物结合口袋对前手性酮pro-R和pro-S两种构象的选择性结合，是其底物依赖型立体选择性的结构和能量基础。其中，卤代苯乙酮仅以pro-S构象结合，专一生成S-构型醇。而4-苯基-2-氧代丁酸乙酯(OPBE)同时存在pro-R和pro-S两种结合构象，导致其产物选择性较低。通过分子动力学轨迹分析，预测93、149和193三个位点是影响OPBE在结合口袋中定位的关键残基。分别构建单点或者双点突变库，研究不同取代残基对产物选择性的影响。结果表明，193单一位点对立体选择性影响显著，W193L、W193V和W193I三个突变株将产物(R）-4-苯基-2-羟基丁酸乙酯(R-HPBE) ee值从野生型的43.2％提高到100％，同时大幅提高催化比活;而93和149两个位点通过协同作用影响立体选择性，双点突变C93V/Y149A将产物选择性逆转到79％(生成S-HPBE)。最后，利用重组W193L Ecoli BL21作为催化剂，实现了500mMOPBE有效转化，且专一生成R-HPBE(ee＞99.5％)。