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采集自然感染温氏附红细胞体的牛血,用柠檬酸钠抗凝,制成血压片和姬姆萨染色的血涂片,光学显微镜下观察红细胞及附红细胞体的形态。附红细胞体单个或聚合在一起存在于血浆中,附有附红细胞体的红细胞发生变形,姬姆萨染色后附红细胞体被染成淡紫色。对采集的血液按其镜检感染率进行分组,分别测定其一氧化氮(NO)含量、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果显示,随着附红细胞体感染强度的增加,血浆中相应的NO和MDA含量逐渐升高,SOD活力逐渐降低。表明这三种生化指标的变化与附红细胞体的感染有关。 无菌采集自然感染附红细胞体的抗凝血,通过PBS-T缓冲液洗涤、高速低温离心和超声波裂解等方法获得纯化的温氏附红细胞体抗原。将该抗原按常规方法免疫家兔,制备了兔抗温氏附红细胞体的高免血清。运用辛酸硫酸铵法提取血清中的免疫球蛋白IgG,聚丙烯酰胺(PAGE)垂直板电泳结果显示所提取的IgG纯度较高,并且此法操作简便,表明其是一种实用高效的抗体提纯方法。 将提取的免疫球蛋白IgG,用过碘酸钠改良法制备酶标抗体,建立了从血液中检测奶牛温氏附红细胞体抗原的双抗体夹心ELISA。试验最佳条件为,抗体最适包被量为156μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1∶400稀释,抗原及酶标抗体的作用时间分别为37℃1h,封闭液为5%犊牛血清,底物显色时间为15min。对温氏附红细胞体抗原的最低检出量为6.64μg/mL。全血及带有附红细胞体的红细胞与纯化抗体反应的最大稀释倍数分别为1∶160和1∶40,可按照此浓度检测血液中的附红细胞体抗原。对该方法进行特异性阻断试验、交叉性试验和重复性试验,结果表明它是一种特异、灵敏、快速的诊断方法,并适合作群体检测。 从河北省不同地区采集奶牛血样222份,应用建立的双抗体夹心ELISA检测方法对其进行检测,结果阳性检出率为91.0%,说明本省奶牛群中温氏附红细胞体感染普遍。本次调查揭示了河北省牛群尤其是规模化牛场中温氏附红细胞体的感染情况,从而为牛附红细胞体病的综合防制提供可靠依据。 本试验根据温氏附红细胞体的16 S rRNA基因参考序列的保守区,利用软件Primer 5.0设计合成了一对特异性引物,对温氏附红细胞体的基因组DNA进行了PCR检测,扩增出一段985 bp的DNA序列,EcoR Ⅰ酶切鉴定得到两条500 bp左右的条带,与预期结果一致,说明该方法扩增出了温氏附红细胞体的特异性条带。通过敏感性、特异性、重复性和扩大性试验证明,该方法具有特异、灵敏、快速的优点,可用于牛附红细胞体病诊断和流行情况监测。