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研究背景和目的:骨髓瘤是一种起源于骨髓造血组织、以浆细胞为主的恶性肿瘤,由于其易产生多发性骨损害,故也称为多发性骨髓瘤（Multiplemyeloma,MM）,发病率在血液恶性肿瘤中位居第二位。MM危害大,发病率逐年升高。新型药物和治疗方案的出现提高了患者的临床疗效,但是大部分患者都会再度发作。目前对复发没有有效治疗方法,亟需新的治疗方法和联合治疗方案。腺嘌呤N6-甲基化（N6-methyladenosine,m6A）调控RNA降解,剪切,核输出等过程,影响基因表达,与多种生理和疾病过程相关,尤其是肿瘤的形成和发展。HNRNPA2B1是一组多功能的RNA结合蛋白,在转录过程中的多个重要环节发挥作用,被证实与多种关键的细胞功能相关。肿瘤的发生发展是由于多种信号通路异常调节导致的,因此,研究肿瘤细胞中致病基因及其调控的信号通路,揭示肿瘤的发病机制,是肿瘤诊断治疗及靶向药物研发的基础,是肿瘤领域中的重要研究方向。本课题首先验证基因芯片筛选出的HNRNPA2B1基因与MM病人生存率及发生发展的作用,通过一系列细胞及动物模型实验探究HNRNPA2B1参与的RNA m6A甲基化（N6-methyladenosine）修饰影响MM的具体调控机制,并寻找靶向HNRNPA2B1调控网络的可以抑制MM细胞增殖的中药单体药物,为MM的治疗提供理论基础。研究方法:1.利用慢病毒包装构建HNRNPA2B1过表达（OE）和shRNA敲低（KD）的稳转细胞株;采用MTT增殖实验检测HNRNPA2B1基因对细胞活力影响;通过流式细胞术（FCM）和蛋白质印迹法（WB）检测凋亡相关指标观察HNRNPA2B1对MM细胞凋亡的影响;NOD-SCID小鼠皮下注射HNRNPA2B1过表达的ARP1细胞株构建异种移植小鼠模型,通过荷瘤体积、重量和生存期验证HNRNPA2B1体内促癌功能。2.利用m6A甲基化测序技术（MeRIP-Seq）寻找HNRNPA2B1通过m6A途径调控的下游基因;qPCR和WB验证HNRNPA2B1敲低、过表达以及m6A合成抑制剂环亮氨酸作用48 h后,ILF3 RNA和蛋白表达,验证m6A参与HNRNPA2B1对ILF3基因的调控。3.用HNRNPA2B1抗体对ARP1野生型和HNRNPA2B1敲低细胞株进行RNA免疫共沉淀（RIP）,通过qPCR比较ILF3的富集量,验证HNRNPA2B1蛋白与ILF3RNA是否直接结合。HNRNPA2B1在细胞内的功能与其核质分布相关,通过免疫荧光共染实验检测HNRNPA2B1和ILF3的亚细胞定位,推断HNRNPA2B1蛋白对ILF3基因的具体调控作用。利用RNA降解实验（RNA合成抑制剂放线菌素D处理,5 μg/mL）,验证HNRNPA2B1蛋白对ILF3 RNA的稳定作用。基于基因芯片数据提示ILF3是MM中的癌基因,构建ILF3敲低的稳转细胞株,通过MTT增殖实验和凋亡实验,验证ILF3是否也促进MM发生发展。4.对ARP1细胞进行RNA免疫共沉淀-测序（RIP-Seq）,寻找ILF3作用的下游基因。用qPCR和WB验证ILF3敲低后AKT3 RNA和蛋白表达,验证ILF3与AKT3 RNA直接结合;利用RNA降解实验,验证ILF3蛋白对AKT3 RNA有稳定作用。用qPCR和WB验证HNRNPA2B1对AKT3 RNA和蛋白表达的影响;利用小干扰技术沉默HNRNPA2B1过表达细胞中AKT3,观察AKT3沉默后MM细胞的增殖,探讨HNRNPA2B1对MM的促癌作用与AKT3的关系。5.利用WB检测不同浓度中药单体药物作用MM细胞48 h后HNRNPA2B1表达情况,寻找靶向作用HNRNPA2B1蛋白的中药单体药物。研究结果:1.基因芯片技术表明HNRNPA2B1在MM患者中表达高于正常（NP）和意义未定的单克隆丙种球蛋白病患者（MGUS）,高表达HNRNPA2B1导致患者总生存期缩短;MTT增殖实验表明,HNRNPA2B1敲低抑制MM细胞增殖,过表达促进细胞增殖;FCM检测到HNRNPA2B1敲低细胞中凋亡明显,HNRNPA2B1敲低后Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3蛋白表达显著增加,表明HNRNPA2B1抑制MM细胞凋亡;小鼠体内试验表明HNRNPA2B1过表达后皮下肿瘤重量和体积显著大于对照组。上述实验揭示HNRNPA2B1在MM中是促癌基因,促进MM的形成,发生和发展。2.MeRIP-Seq表明ILF3 RNA 3’-非编码区上发生明显的m6A修饰,与对照组相比,HNRNPA2B1敲低组检测到的ILF3转录本显著减少;HNRNPA2B1敲低后,ILF3 RNA和蛋白表达均降低,HNRNPA2B1过表达后促ILF3 RNA和蛋白表达;加入m6A合成抑制剂环亮氨酸后,ILF3mRNA和蛋白水平均降低,且与环亮氨酸浓度相关;RIP-qPCR表明,与IgG组相比,HNRNPA2B1与ILF3 RNA结合明显增加,HNRNPA2B1敲低后,检测到的ILF3 RNA量显著降低,说明HNRNPA2B1蛋白与ILF3 RNA直接结合;RNA降解实验表明,加入放线菌素D后,与对照组比较,HNRNPA2B1敲低后,ILF3 RNA稳定性降低。3.RIP-Seq 实验显示 ILF3 蛋白与 AKT3 RNA 上 Exon3,10 和 Intron2,3,10直接结合;ILF3敲低后AKT3 mRNA和蛋白表达量均降低;RIP-qPCR表明,ILF3敲低后,ILF3蛋白与AKT3 RNA结合量减少;RNA降解实验表明,ILF3敲低后,AKT3 RNA降解增加。4.HNRNPA2B1敲低后,AKT3 RNA和蛋白表达均降低;SiAKT3沉默HNRNPA2B1过表达细胞中的AKT3后,HNRNPA2B1过表达引起的增殖被抑制。5.蟾毒灵,去甲斑蝥素,青蒿素,足节香附素A和藤黄酸作用于MM细胞后,HNRNPA2B1蛋白表达降低,其中蟾毒灵,去甲斑蝥素和藤黄酸组蛋白降低明显,表明这些中药单体药物可能通过作用HNRNPA2B1表达抑制MM细胞生长。结论:本研究从临床、细胞和动物层面明确了HNRNPA2B1对MM中的致癌作用,综合运用MeRIP-Seq、RIP-Seq等高通量测序和生化分子生物学技术手段,从表观遗传学层面揭示了 m6A/NRNPA2B1/ILF3/AKT3调控网络。我们的结果显示蟾毒灵,去甲斑蝥素,青蒿素,足节香附素A和藤黄酸影响HNRNPA2B1蛋白表达,HNRNPA2B1可能是MM治疗药物靶点。