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研究背景:胃癌(gastric cancer)是世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤,据2018年世界卫生组织及国际癌症研究机构的全球癌症(GLOBOCAN)统计报告显示,全球胃癌每年新发病例104万,位列恶性肿瘤新发患者数第5位,死亡人数78万,位列恶性肿瘤死亡人数第3位。胃癌发病率在亚洲东部(特别是韩国、蒙古、日本和中国等国家)及中欧和南美洲最高。据国家癌症登记中心(NCCR)的调查结果显示,我国每年约有41万新发胃癌病例,死亡病例数约29万。与此同时,胃癌还具有预后差、死亡率高的特点,其五年生存率只有30%左右。随着胃癌诊疗手段和策略的逐步完善及对其分子机制的理解加深,胃癌整体的发病率及病死率呈现下降趋势,尽管如此,由于存在远距离转移和复发的特点,仍然面临巨大挑战。因此,有必要对胃癌进展的分子机制进行深入探讨,以便为患者发现新的有效治疗策略。长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸的内源性RNA。目前为止人们发现lncRNA在多种生物学过程中发挥重要作用,例如细胞增殖、分化和癌变等。近年来,越来越多的报导称lncRNA在胃癌组织中的表达失调,包括ZEB1-AS1、PVT1、MALAT1、HOTAIR、NEAT1、CCAT1、ANRIL、PANDAR。ZEB1-AS1是lncRNA家族的一个成员,研究发现它在多种癌症中呈现高表达状态,包括肝细胞癌、骨肉瘤、脑胶质瘤和食管癌。其中人们发现在肝细胞癌中与正常肝组织相比,ZEB1-AS1在癌组织内的表达升高,而在转移的肿瘤组织中表达量与原发肿瘤组织相比更高;ZEB1-AS1在食管鳞状细胞癌组织中的表达与癌旁组织相比也较高,且与肿瘤分级、浸润深度、淋巴结转移有关;此外,ZEB1-AS1表达在骨肉瘤组织和细胞株中表达量的增加与肿瘤大小、Enneking分期、肿瘤转移相关;而其在脑胶质瘤组织标本中的高表达是与WHO临床分期密切相关的。值得注意的是,这种ZEB1-AS1高表达与患者的不良预后密不可分:ZEB1-AS1高表达的肝癌患者易复发、生存率较低;ZEB1-AS1高表达与食管鳞状细胞癌和骨肉瘤患者较差的无复发生存期和总生存期相关;脑胶质瘤中,ZEB1-AS1的表达水平与患者的总生存率呈负相关。这些结果暗示ZEB1-AS1高表达可能在人类癌症的发病机制中发挥不利的作用。然而,ZEB1-AS1在胃癌中的临床意义及其相关分子机制尚未有研究。上皮间质转化(EMT)是癌转移中一个复杂的病理过程,其特点为上皮细胞具有迁移和转化为侵袭性间充质细胞的潜力。ZEB1是这个过程的一个关键转录因子,它可以通过促进EMT过程而加速癌细胞的侵袭和转移。基因组研究显示ZEB1是E盒锌指蛋白1基因,ZEB1-AS1是E盒锌指蛋白1基因的反义蛋白产物,位于人类10号染色体短臂11区22带上(Chr10p11.22),ZEB1内含子区的反链上包含有ZEB1-AS1基因的单外显子。后者可以在人类癌细胞中作为增强子,提高ZEB1启动子的活性。此外,ZEB1-AS1可以通过调节ZZEB1的活性,在肿瘤细胞迁移、侵袭及EMT过程中充当一个关键的调节因子。基于以往的研究,我们推测ZEB1-AS1同样是通过调节ZEB1基因,在胃癌细胞迁移、侵袭及EMT中起到促进作用。研究目的:本研究在之前报导的基础上,经过大量实验,拟解决以下几点问题:ZEB1-AS1基因的表达水平与胃癌发生、进展的相关性如何?其次,对ZEB1-AS1基因及其相关基因ZEB1调控胃癌发展的分子机制进行研究,并为伴有ZEB1-AS1表达异常的胃癌患者进行预后判断和靶向治疗提供新的理论依据。研究对象和方法:对象:随机选取2009年1月到2015年12月期间在山东大学附属山东省肿瘤医院就诊的124例胃癌患者和20例胃炎患者。方法:1.手术取胃癌组织及周围正常胃部组织及部分癌转移患者的转移性淋巴结;以及胃炎患者的炎症组织部位。定量PCR检测各组织中ZEB1-AS1基因的表达量,并进行比较,研究其表达量与胃癌发生之间的潜在关系。2.根据ZEB1-AS1在胃癌组织中的表达水平,将124例患者分为高表达和低表达两组(每组病例62例),分别评价表达水平高低与患者性别、年龄、肿瘤深度(T1-T2与T3-T4)、组织学分化类型、临床分期(Ⅰ-Ⅱ期与Ⅲ-Ⅳ期)、淋巴结转移(不多于6个及6个以上相比)以及远处转移的关系;Kaplan-Meier检验分析ZEB1-AS1表达量与患者整体生存期的关系;通过单一变量和多变量Cox回归分析评价ZEB1-AS1表达量及各临床病理特征与预后的关系。3.根据胃癌组织中ZEB1-AS1的中位表达水平,将胃癌组织中ZEB1-AS1的表达量分为高表达组和低表达组,RT-PCR和免疫组化分别检测ZEB1在mRNA及蛋白水平上的表达量,判断其是否与ZEB1-AS1的表达水平有相关关系;4.用定量PCR检测人胃癌细胞系NCI-N87、SNU-1、AGS、MKN-45及人类正常胃部上皮细胞系GES-1中ZEB1-AS1的表达水平。并确认ZEB1-AS1表达水平最高、最低(以下简称A、B细胞)的两种胃癌细胞系。在A细胞系中干扰ZEB1-AS1表达,观察ZEB1在mRNA及蛋白水平上的表达量变化;在B细胞中过表达ZEB1-AS1,观察ZEB1表达量变化,从而进一步判断ZEB1-AS1是否参与调节ZEB1的表达。5.在细胞中分别干扰、过表达ZEB1-AS1,分别用Boyden和Transwell试验观察细胞迁移、侵袭的能力变化;检测细胞内上皮细胞标志物ZO-1、E-Cadherin及间质细胞标志物Vimentin、N-Cadherin蛋白表达水平,来判断ZEB1-AS1对迁移、侵袭、EMT的影响。6.功能恢复实验验证ZEB1-AS1与ZEB1的关系:在细胞中共转染si-ZEB1-AS1和pcDNA-ZEB1,采用观察ZEB1过表达是否可以使ZEB1-AS1干扰所导致的迁移、侵袭、EMT能力得到恢复;同样地,共转染pcDNA-ZEB1-AS1和si-ZEB1,观察上述能力是否能够恢复。实验结果:1.定量PCR结果显示,ZEB1-AS1在胃癌组织中的表达高于相邻正常胃组织和胃炎组织(P<0.001)。同时,我们观察到ZEB1-AS1在转移性淋巴结中表达量比原发性胃癌组织要高出很多,具有显著差异。此外,我们评估了胃癌细胞以及人正常胃黏膜上皮细胞中ZEB1-AS1的表达量。与正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比,ZEB1-AS1在胃癌细胞株(NCI-N87、SNU-1、AGS和MKN-45)中的表达水平显著增加(P<0.001)。ZEB1-AS1在NCI-N87细胞中表达量最低,在MKN-45中最高。2.对124例胃癌患者的ZEB1-AS1表达量与临床病理学指标的相关性进行分析。统计分析显示ZEB1-AS1表达与性别(P=0.067)、年龄(P=0.584)、肿瘤深度(P=0.854)无显著相关性。相反,ZEB1-AS1的表达与组织学类型(P=0.031)、临床分期、淋巴结转移、以及远处转移显著相关,后三者P值均<0.001。Kaplan Meier试验分析表明ZEB1-AS1表达与胃癌患者总体生存率之间存在较强的统计学相关性(P<0.001)。采用单因素和多因素Cox回归分析检测胃癌患者的不良预后因素。通过单因素分析发现,无论临床分期、肿瘤深度、淋巴结转移、远处转移的情况如何,ZEB1-AS1高表达是胃癌患者预后不良的一个重要因素(P<0.001)。此外,基于多变量分析我们还证实了 ZEB1-AS1高表达是胃癌患者预后独立的不良因素(HR=2.363,95%CI:1.410-3.962,P = 0.001)。3.ZEB1-AS1位于人类10号染色体短臂11区22带上(Chr1Op11.22),ZEB1内含子区包含ZEB1-AS1基因反向链的单外显子。通过qRT-PCR检测发现ZEB1-AS1与ZEB1 mRNA在胃癌组织中的表达呈正相关(r=0.812,P<0.001)。此外,免疫组化结果显示ZEB1蛋白的表达量与ZEB1-AS1 lncRNA的表达量呈正相关(r=0.455,P=0.004)。4.干扰ZEB1-AS1在MKN-45细胞系中的表达,则ZEB1在mRNA和蛋白水平上的表达量较对照组均有明显降低(P<0.001),而ZEB1-AS1过表达的NCI-N87细胞中,ZEB1 mRNA和蛋白较对照组显著增加(P<0.001)。因此可以看出,无论在mRNA还是蛋白水平上,ZEB1的表达量都受ZEB1-AS1的正向调节。5.干扰ZEB1-AS1表达可以抑制胃癌细胞迁移,并且过表达ZEB1-AS1可以刺激胃癌细胞迁移(P值均<0.001)。同样,通过干扰ZEB1-AS1的表达,可以抑制胃癌细胞的侵袭能力,而增加ZEB1-AS1的表达,来促进胃癌细胞的侵袭能力,这种影响与对照组相比有显著差异。另外,ZEB1-AS1表达降低可以使上皮标记物ZO-1和E-Cadher i n的表达量增加,并且可以使间充质标志物Vimentin和N-cadherin的表达降低。另一方面,上调ZEB1-AS1表达可以抑制上皮标记物Z0-1和E-cadherin的表达,而促进间充质标记物Vimentin和N-Cadherin蛋白的表达。6.值得注意的是,ZEB1过表达可以增强si-ZEB1-AS1介导的对胃癌细胞迁移、侵袭和EMT过程的调节作用;同时将pcDNA-ZEB1-AS1和si-ZEB1转染到NCI-N87细胞中,发现干扰ZEB1表达可以抑制ZEB1-AS1介导的对胃癌细胞迁移、侵袭和EMT过程的促进作用。实验结论:总之,我们的实验证实了 ZEB1-AS1在胃癌组织和细胞系中高表达,且与胃癌组织学类型、临床分期、淋巴结转移、远处转移和预后相关。另外,ZEB1-AS1通过调节ZEB1在胃癌细胞迁移、侵袭和EMT过程中起着致癌作用。