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帕金森病(PD)伴随的认知障碍是临床中典型的非运动症状，其中，学习记忆障碍是PD认知障碍的一种重要表现。环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)是一种具有转录功能的细胞因子，被激活磷酸化后对学习记忆进行调控。骨髓间充质干细胞(BMSCs)经验证通过脑内移植可改善PD模型大鼠的运动障碍症状。本实验在探讨PD模型大鼠学习记忆障碍的发生发展与脑纹状体内p-CREB蛋白水平变化的基础上，向PD模型大鼠的脑纹状体内植入CREB基因修饰的BMSCs（CREB-BMSCs），探讨移植CREB-BMSCs后PD模型大鼠学习记忆障碍的改善效果。
1.PD模型大鼠学习记忆能力的变化及脑纹状体内p-CREB表达水平的研究
运用脑立体定位仪，单侧脑纹状体内注射6-OHDA构建PD模型大鼠。2周后通过腹腔注射阿扑吗啡(APO)的方式诱导转圈，挑选符合标准的实验大鼠。造模2周、5周、8周后采用Morris水迷宫实验检测PD模型大鼠的学习记忆能力，采用免疫组织化学技术检测PD模型大鼠造模侧脑纹状体内的p-CREB阳性细胞，Western blot检测脑纹状体中p-CREB的蛋白水平。
造模2周后筛选的成功模型（诱导转圈≥7r/min）在5周、8周时的旋转圈数分别为9.13±0.62r/min、10.06±0.68r/min，表明PD模型稳定。Morris水迷宫实验结果显示，PD模型大鼠在目标平台象限内的时间均极显著低于正常大鼠(p＜0.01，n=10)，且随造模时间的延长逐渐缩短，提示PD大鼠的学习记忆能力逐渐衰退。免疫组织化学分析可见随病程发展PD模型大鼠脑纹状体内的p-CREB阳性棕染细胞随病程发展数量逐渐减少。Western blot检测结果显示PD模型大鼠脑纹状体内p-CREB的表达水平降低，均极显著低于正常大鼠(p＜0.01，n=5)。研究结果表明随着PD病程的发展PD模型大鼠的学习记忆能力逐渐衰减，此外，脑纹状体内p-CREB的表达量也不断下降，提示PD模型大鼠的学习记忆能力出现障碍可能与脑纹状体内p-CREB的水平降低有关。
2.大鼠BMSCs的CREB基因修饰
通过Lipofectin2000将重组真核表达载体pCDNA3.1(+)-CREB转染至BMSCs，构建CREB-BMSCs。利用免疫荧光技术检测表达p-CREB的阳性细胞，Western blot方法检测CREB-BMSCs内p-CREB的蛋白表达。通过β-巯基乙醇诱导体外培养的CREB-BMSCs向神经元样细胞进行分化，探讨CREB基因修饰的BMSCs的分化能力以及分化后细胞内p-CREB的蛋白表达水平。
由CREB重组载体的酶切结果与测序结果可知，本研究构建出CREB基因修饰的BMSCs;与对照组细胞相比，CREB-BMSCs组FITC染色阳性细胞明显增多，并且p-CREB的表达量极显著升高(p＜0.01，n=5)。体外培养的CREB-BMSCs诱导分化后，细胞中三种神经元标志性蛋白NSE、Nestin和GFAP的检测结果均呈阳性。结果提示，CREB-BMSCs仍具有分化为神经元样细胞的潜力，且分化后仍能表达p-CREB。
3.CREB-BMSCs移植改善PD模型大鼠学习记忆能力的研究
将造模5周后的实验大鼠随机分为PBS组、BMSCs组和CREB-BMSCs组，每组大鼠脑内分别定点注射10μL的PBS、BMSCs（105个/μL）、CREB-BMSCs（105个/μL）。移植2周、5周、8周后腹腔注射APO诱导转圈，采用Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力的变化;利用免疫组织化学技术检测各移植组大鼠脑纹状体内表达p-CREB的阳性细胞，Western blot方法检测实验大鼠脑纹状体内p-CREB的蛋白水平，比较分析各组的改善效果。
与PBS组大鼠相比，移植后BMSCs组与CREB-BMSCs组大鼠的旋转圈数均逐渐下降，且5周后CREB-BMSCs组的旋转圈数极显著低于BMSCs组（4.67±0.87r/min vs.5.73±0.77r/min，p＜0.01，n=20）。Morris水迷宫检测结果显示BMSCs组实验大鼠的学习记忆障碍得到相应改善，学习记忆能力逐渐提高;并且在相同时间内CREB-BMSCs移植对学习记忆障碍的改善效果更优于BMSCs，8周后CREB-BMSCs组平台象限时间极显著多于BMSCs组（26.36±1.73s vs.19.34±1.51s，p＜0.01，n=10）。免疫组织化学结果显示BMSCs组大鼠脑纹状体内的阳性细胞数缓慢增加;CREB-BMSCs组阳性细胞数量增长较多，效果显著。蛋白检测结果显示移植2周、5周、8周后，CREB-BMSCs组大鼠脑纹状体内p-CREB的表达量高于BMSCs组，差异极显著(p＜0.01，n=5)，与脑组织内阳性细胞检测结果一致。研究结果提示，通过脑纹状体内移植BMSCs和CREB-BMSCs，PD模型大鼠脑纹状体内p-CREB的表达量逐渐增加，学习记忆能力也相应提高，且移植CREB-BMSCs能更有效地改善实验大鼠的学习记忆功能障碍。
本研究结果提示，CREB-BMSCs移植入PD大鼠脑内后可能发生迁移、分化为神经元样细胞，并通过增加p-CREB的表达，改善PD运动障碍及学习记忆障碍。本研究为临床基因治疗PD运动障碍及学习记忆障碍提供实验基础。
1.PD模型大鼠学习记忆能力的变化及脑纹状体内p-CREB表达水平的研究
运用脑立体定位仪，单侧脑纹状体内注射6-OHDA构建PD模型大鼠。2周后通过腹腔注射阿扑吗啡(APO)的方式诱导转圈，挑选符合标准的实验大鼠。造模2周、5周、8周后采用Morris水迷宫实验检测PD模型大鼠的学习记忆能力，采用免疫组织化学技术检测PD模型大鼠造模侧脑纹状体内的p-CREB阳性细胞，Western blot检测脑纹状体中p-CREB的蛋白水平。
造模2周后筛选的成功模型（诱导转圈≥7r/min）在5周、8周时的旋转圈数分别为9.13±0.62r/min、10.06±0.68r/min，表明PD模型稳定。Morris水迷宫实验结果显示，PD模型大鼠在目标平台象限内的时间均极显著低于正常大鼠(p＜0.01，n=10)，且随造模时间的延长逐渐缩短，提示PD大鼠的学习记忆能力逐渐衰退。免疫组织化学分析可见随病程发展PD模型大鼠脑纹状体内的p-CREB阳性棕染细胞随病程发展数量逐渐减少。Western blot检测结果显示PD模型大鼠脑纹状体内p-CREB的表达水平降低，均极显著低于正常大鼠(p＜0.01，n=5)。研究结果表明随着PD病程的发展PD模型大鼠的学习记忆能力逐渐衰减，此外，脑纹状体内p-CREB的表达量也不断下降，提示PD模型大鼠的学习记忆能力出现障碍可能与脑纹状体内p-CREB的水平降低有关。
2.大鼠BMSCs的CREB基因修饰
通过Lipofectin2000将重组真核表达载体pCDNA3.1(+)-CREB转染至BMSCs，构建CREB-BMSCs。利用免疫荧光技术检测表达p-CREB的阳性细胞，Western blot方法检测CREB-BMSCs内p-CREB的蛋白表达。通过β-巯基乙醇诱导体外培养的CREB-BMSCs向神经元样细胞进行分化，探讨CREB基因修饰的BMSCs的分化能力以及分化后细胞内p-CREB的蛋白表达水平。
由CREB重组载体的酶切结果与测序结果可知，本研究构建出CREB基因修饰的BMSCs;与对照组细胞相比，CREB-BMSCs组FITC染色阳性细胞明显增多，并且p-CREB的表达量极显著升高(p＜0.01，n=5)。体外培养的CREB-BMSCs诱导分化后，细胞中三种神经元标志性蛋白NSE、Nestin和GFAP的检测结果均呈阳性。结果提示，CREB-BMSCs仍具有分化为神经元样细胞的潜力，且分化后仍能表达p-CREB。
3.CREB-BMSCs移植改善PD模型大鼠学习记忆能力的研究
将造模5周后的实验大鼠随机分为PBS组、BMSCs组和CREB-BMSCs组，每组大鼠脑内分别定点注射10μL的PBS、BMSCs（105个/μL）、CREB-BMSCs（105个/μL）。移植2周、5周、8周后腹腔注射APO诱导转圈，采用Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力的变化;利用免疫组织化学技术检测各移植组大鼠脑纹状体内表达p-CREB的阳性细胞，Western blot方法检测实验大鼠脑纹状体内p-CREB的蛋白水平，比较分析各组的改善效果。
与PBS组大鼠相比，移植后BMSCs组与CREB-BMSCs组大鼠的旋转圈数均逐渐下降，且5周后CREB-BMSCs组的旋转圈数极显著低于BMSCs组（4.67±0.87r/min vs.5.73±0.77r/min，p＜0.01，n=20）。Morris水迷宫检测结果显示BMSCs组实验大鼠的学习记忆障碍得到相应改善，学习记忆能力逐渐提高;并且在相同时间内CREB-BMSCs移植对学习记忆障碍的改善效果更优于BMSCs，8周后CREB-BMSCs组平台象限时间极显著多于BMSCs组（26.36±1.73s vs.19.34±1.51s，p＜0.01，n=10）。免疫组织化学结果显示BMSCs组大鼠脑纹状体内的阳性细胞数缓慢增加;CREB-BMSCs组阳性细胞数量增长较多，效果显著。蛋白检测结果显示移植2周、5周、8周后，CREB-BMSCs组大鼠脑纹状体内p-CREB的表达量高于BMSCs组，差异极显著(p＜0.01，n=5)，与脑组织内阳性细胞检测结果一致。研究结果提示，通过脑纹状体内移植BMSCs和CREB-BMSCs，PD模型大鼠脑纹状体内p-CREB的表达量逐渐增加，学习记忆能力也相应提高，且移植CREB-BMSCs能更有效地改善实验大鼠的学习记忆功能障碍。
本研究结果提示，CREB-BMSCs移植入PD大鼠脑内后可能发生迁移、分化为神经元样细胞，并通过增加p-CREB的表达，改善PD运动障碍及学习记忆障碍。本研究为临床基因治疗PD运动障碍及学习记忆障碍提供实验基础。