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本研究基于家蚕全基因组序列,利用RT—PCR技术和原位杂交技术对家蚕BmETH基因和BmETHR基因进行了克隆和表达特征分析。主要获得的结果如下:
1.获得了家蚕BmETH和BmETHR基因的全长ORF和相关的基因组结构信息。
BmETH基因的ORF长为303bp,由2个内含子和3个外显子构成,编码100个氨基酸,蛋白预测分子量11.49 kD,等电点是7.51。BmETH编码的第1到15个氨基酸为信号肽。多序列比对结果表明,昆虫ETH基因在昆虫进化过程中分化较明显。聚类分析显示,黑腹果蝇和埃及伊蚊两个双翅目(Diptera)昆虫的ETH基因聚成一类,烟草天蛾与家蚕两个鳞翅目(Lepidoptera)的ETH基因聚成一类,而蜜蜂和丽蝇蛹集金小蜂两个膜翅目(Hymenoptera)的ETH基因聚为一类。
BmETHR基因ORF长810bp,无内含子,共编码269个氨基酸,蛋白预测分子量31.07kD,等电点是9.91。BmETH编码的氨基酸序列中,31-53和68-90位区域为两个跨膜区。蛋白质序列含有跨膜结构域区提示它可能作为膜受体起作用,也可能是定位于膜的锚定蛋白或者离子通道蛋白。多序列比对结果表明,ETHR蛋白序列在昆虫的进化过程中比较保守,烟草天蛾和家蚕两个鳞翅目昆虫的ETHR基因的进化关系最近。
2.BmETH基因及其受体BmETHR基因的表达特征分析。
利用RT—PCR技术,我们分析了BmETH基因和BmETHR基因在胚胎期,幼虫期,变态期以及幼虫5龄3天各个组织中的表达情况。结果表明,胚胎发育期间,BmETH基因在产卵后3天开始表达,在产卵后4天、5天、6天、7天、8天和9天,表达量逐渐提高,而在孵化时的表达量又开始降低。在幼虫生长发育中,BmETH基因几乎都是在每个龄期蜕皮前上调表达;在变态发育过程中,BmETH在吐丝前、化蛹前和化蛾前上调表达。BmETH的时期表达特征暗示其与胚胎形态发生及幼虫或蛹期蜕皮紧密相关。在幼虫5龄3天各组织中,BmETH基因仅在气管、丝腺、精巢和中肠等组织中高量表达,这与其他昆虫中.ETH基因仅在气管中高量表达的特征有些差异。
在不同发育阶段,BmETHR的表达一般随BmETH的表达量变化发生一定程度的变化,提示其与ETH的信号传导相关;但是,BmETHR在胚胎发育早期也有表达,而在幼虫5龄3天的丝腺和中肠组织中低量表达,与ETH的表达并无相关性,暗示其可能不受ETH的调节。
此外,我们利用在家蚕中已建立的组织原位杂交技术,对家蚕.BmETH基因在气管中的表达进行了组织定位,结果表明家蚕BmETH基因在气管丛附着的气门上腺中的Inka细胞中表达。