siRNA沉默Id1基因对小鼠骨肉瘤细胞增殖、迁移及凋亡的影响

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目的探究Id1基因在小鼠来源间充质干细胞(C3H10)、成骨细胞(MC3T3-E1)及骨肉瘤细胞(K7M2-WT)中的表达情况,并以K7M2-WT细胞为研究对象,用特异性针对小鼠Id1基因的小干扰RNA重组腺病毒(AdsimId1)感染骨肉瘤细胞,进一步研究Id1基因沉默后对骨肉瘤细胞增殖、迁移及凋亡的影响。方法将小鼠C3H10、MC3T3-E1、K7M2-WT用含10%胎牛血清DMEM的培养基培养,置于37℃、5%CO2培养箱中;分别取生长状态良好的细胞, Trizol法提取细胞总RNA,逆转录获得cDNA,RT-PCR检测Id1基因mRNA水平的表达情况;提取细胞总蛋白,蛋白质印迹法检测Id1基因蛋白的水平表达情况。用制备的特异性针对小鼠Id1基因的小干扰RNA重组腺病毒(AdsimId1)和空病毒对照组(AdsiRNA)感染K7M2-WT骨肉瘤细胞,同时设未加病毒组(Control组),RT-PCR、Western Blot检测沉默是否成功; MTT法检测Id1基因沉默后K7M2-WT细胞的增殖情况;划痕实验及Transwell小室法检测细胞迁移情况;DAPI染色法检测Id1基因沉默后骨肉瘤细胞凋亡情况。结果1.实验结果提示:在三种细胞中,Id1基因mRNA及蛋白水平在C3H10的表达量最高,K7M2-WT细胞其次,MC3T3-E1细胞表达最低。2. RT-PCR及Western Blot检测结果显示重组腺病毒AdsimId1感染3d后K7M2-WT细胞Id1基因mRNA及蛋白水平的表达较对照组明显降低(P<0.05)。3. MTT显示Control组、AdsiRNA组和AdsimId1组OD值分别为(0.52±0.032)、(0.49±0.01)、(0.22±0.0063),Id1基因沉默后抑制K7M2-WT细胞的增殖,相对Control组及AdsiRNA组抑制率分别为58%和55%(P<0.05);4.细胞划痕实验结果显示,与Control组及AdsiRNA组比较,AdsimId1组K7M2-WT细胞在Id1低表达状态下的迁移速度明显减慢(P<0.05)。5. Transwell实验结果:AdsimId1组的穿膜细胞数为(44.7±3.7)个,显著少于Control组(100.3±3.8)个及AdsiRNA组(103.8±4.4)个(P<0.05);6. DAPI结果提示:AdsimId1沉默K7M2-WT细胞Id1基因表达后可诱导骨肉瘤细胞的凋亡且高于对照组。结论在C3H10、MC3T3-E1及K7M2-WT细胞中,间充质干细胞C3H10Id1表达最高,处于同一分化阶段的MC3T3-E1和K7M2-WT细胞中,K7M2-WT细胞显示Id1呈高表达;通过重组腺病毒介导Id1小分子干扰RNA能有效沉默K7M2-WT细胞的Id1基因表达;Id1基因沉默后K7M2-WT细胞增殖和迁移能力均不同程度受到抑制;沉默Id1基因可诱导K7M2-WT细胞凋亡,提示Id1基因在骨肉瘤的发生、发展过程中具有重要的调控作用,这将为骨肉瘤发病机制的研究提供新的思路,且Id基因可能为骨肉瘤治疗的一个新靶点。
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