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目的:桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT),又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎,是较为常见的内分泌系统疾病,也是自身免疫性甲状腺炎中最常见的临床类型。HT的特点为患者血清中可检测出高效价的抗甲状腺抗原的自身抗体:甲状腺过氧化物酶抗体(Thyroid peroxidase antibody,TPOAb)及甲状腺球蛋白抗体(Thyroglobulin antibody,TgAb);超声检查显示甲状腺组织低回声;同时甲状腺组织切片中有大量的淋巴细胞浸润,并可形成淋巴滤泡。处于HT早期的患者可无明显的临床症状,但随着甲状腺组织不断被淋巴细胞浸润并破坏,疾病进展后期患者可出现甲状腺组织及甲状腺滤泡细胞萎缩,最终导致甲状腺功能减退。遗传因素和环境因素共同参与桥本甲状腺炎的致病过程,但是其具体的发病机制尚未明确。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200核苷酸的非编码RNA,这类RNA不编码蛋白质,其在不改变基因DNA序列的情况下发挥功能的机制成为近年来的研究热点。在以往的研究中,lncRNA已被证实参与一些自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠病的致病过程,但其在HT中发挥的功能我们还知之甚少。本研究的目的是通过筛选HT患者外周血CD4~+T细胞中差异表达的lncRNA,寻找与HT致病相关的lncRNA,并探究其功能及寻找靶基因,从而更深入的理解lncRNA在HT中发挥作用的机制,为寻找HT新的治疗靶点奠定基础。方法:第一部分:招募37名HT患者以及50名性别年龄匹配的健康对照志愿者。采集他们的外周血并用密度离心法提取外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),之后用磁珠分选仪分选CD4~+T细胞。提取各CD4~+T细胞样本总RNA,质控合格的RNA样本进行高通量测序。测序数据进行生物信息学分析。另外招募43名HT患者以及50名性别年龄匹配的健康对照志愿者。采集他们的外周血并用密度离心法提取PBMCs,之后用磁珠分选仪分选CD4~+T细胞。提取各CD4~+T细胞样本总RNA,real-time PCR检测NONHSAT079547.2相对表达量。使用电化学发光法检测所有招募的研究对象的血清中游离T3(Free T3,FT3)、游离T4(Free T4,FT4)、促甲状腺激素(Thyroid stimulatory hormone,TSH)、TPOAb以及TgAb浓度。将NONHSAT079547.2相对表达量与血清FT3、FT4、TSH、TPOAb以及TgAb浓度做相关性分析。第二部分:在Jurkat细胞中转染NONHSAT079547.2沉默质粒使NONHSAT079547.2表达下调。Real-time PCR检测NONHSAT079547.2沉默效率。使用CCK8实验以及流式细胞术检测NONHSAT079547.2表达下调后细胞生长以及凋亡水平。使用Western blot实验检测NONHSAT079547.2表达下调后增殖与凋亡相关蛋白表达水平。利用real-time PCR检测NONHSAT079547.2表达下调后T-bet、IFN-γ、IL-17(IL-17A)、RoRγt、Foxp3以及TGF-βmRNA表达量以及研究对象外周血CD4~+T细胞样本中IL-17 m RNA表达量。使用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测研究对象血清中以及细胞培养上清中IL-17浓度。第三部分:细胞核质分离实验验证NONHSAT079547.2亚细胞定位。生物信息学分析以及靶基因预测网站(LNCediting和TargetScan)预测可以与NONHSAT079547.2及IL-17 mRNA相结合的miRNA。Real-time PCR验证预测得到的miRNA,并使用ELISA检测细胞培养上清中IL-17浓度。使用荧光素酶实验验证miR-4716-5p与NONHSAT079547.2以及IL-17之间直接结合关系。使用RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)验证miR-4716-5p是否通过Ago2蛋白与NONHSAT079547.2结合并行使功能。结果:第一部分:将高通量测序得到的数据进行分析,我们发现HT组与健康对照组纳入对象的CD4~+T细胞样本中共有7564条lncRNA显著差异表达,其中表达上调的lncRNA有3913条,表达下调的lncRNA有3651条。生物信息学分析发现这些差异表达的lncRNA可能参与HT发病机制中。经验证,lncRNA NONHSAT079547.2在HT患者外周血CD4~+T细胞样本中高表达,其表达量与患者血清中TPOAb浓度呈正相关。第二部分:与对照组相比,下调NONHSAT079547.2使细胞增长能力下降但不影响细胞凋亡水平,同样,下调NONHSAT079547.2使细胞增殖相关蛋白PCNA表达下降但不影响凋亡相关蛋白Bcl-xl表达水平。下调NONHSAT079547.2后T-bet、IFN-γ、RoRγt以及Foxp3的表达量无明显改变,TGF-β的表达轻度上升,而IL-17的表达量显著下降。另外我们检测了IL-17在研究对象外周血CD4~+T细胞中表达水平。与对照组相比,IL-17在HT患者外周血CD4~+T细胞中显著高表达。同时我们发现,IL-17表达量与之前实验测得的NONHSAT079547.2表达量存在正相关关系。IL-17在HT患者血清中浓度也明显高于健康对照组。第三部分:NONHSAT079547.2在细胞核中和细胞质中都有表达,在细胞质中的表达稍多与细胞核中。LNCediting以及TargetScan共预测得到8个miRNA可能既与NONHSAT079547.2结合又与IL-17 mRNA结合。进一步使用real-time PCR进行验证,miR-30a-3p以及miR-4716-5p在下调NONHSAT079547.2后表达上升。但是只有过表达或下调mi R-4716-5p可以使IL-17的表达及分泌减少或增多。因此,miR-4716-5p既与NONHSAT079547.2结合又调控IL-17表达及分泌。荧光素酶实验表明miR-4716-5p可以与NONHSAT079547.2以及IL-17 3’UTR直接结合。RIP实验表明miR-4716-5p通过Ago2蛋白结合NONHSAT079547.2并行使功能。结论:HT组与健康对照组研究对象外周血CD4~+T细胞中lncRNA表达存在明显差异,其中NONHSAT079547.2在HT患者外周血CD4~+T细胞中显著高表达。NONHSAT079547.2可以促进细胞生长并通过竞争性结合miR-4716-5p调控IL-17的表达及分泌。因此,本研究首次测定HT患者外周血CD4~+T细胞中lncRNA表达谱,并探讨了NONHSAT079547.2的功能及潜在作用机制,为寻找HT新的治疗靶点奠定基础。