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铜绿假单胞菌作为条件致病菌，极易使免疫受损的病人感染，是造成囊性纤维化和支气管扩张病人慢性感染的最常见微生物，因而受到严格控制。但铜绿假单胞菌在合适的条件下可分泌多种具有生物活性的物质，如鼠李糖脂、脂肽、绿脓菌素等。鼠李糖脂除具有生物表面活性剂特有性质外，还具有抗菌、抑制肿瘤细胞增殖、加快烧伤皮肤的痊愈等功能;脂肽也是一种生物表面活性剂，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤活性，目前已有脂肽类药物应用于临床;绿脓菌素是一种具有氧化还原活性的吩嗪类蓝色色素，因其分子量小易穿透细胞膜，一旦进入细胞会对其产生毒害作用。 本文以高产鼠李糖脂的野生菌为出发菌株，利用大梯度强磁场设备模拟空间条件对其诱变，筛选出一高产正突变菌株。通过发酵条件优化和发酵动力学研究确定了产鼠李糖脂最佳发酵条件和工艺，对该突变菌株的主要代谢产物的分离纯化和结构表征，研究了其代谢产物绿脓菌素、单鼠李糖脂、双鼠李糖脂、脂肽的抗菌和抗肿瘤生物活性，并探索了绿脓菌素的抗肿瘤机理。本文旨在通过研究模拟空间条件诱变获得鼠李糖脂高产菌株的发酵工艺，为鼠李糖脂工业化生产打下基础，同时拟利用该高产菌株寻找新的活性代谢产物，为新生物医药的开发和应用提供依据和参考。本文主要研究工作如下: (1)产鼠李糖脂野生菌的鉴定。野生菌株为本实验室筛选并保藏的高产鼠李糖脂的菌株，为革兰氏阴性杆状细菌，无芽孢、有菌毛，可产生绿色色素，菌落形态为中等大小、不透明白色、圆形、扁平、表面光滑、湿润、边缘齐整;根据吲哚等14项生理生化实验结果，结合形态学特征，参考《伯杰氏鉴定手册》，判断该菌株为假单胞菌属;该菌株的16S rDNA基因序列长度为1450 bp，利用Genbank数据库中BLAST软件进行同源性比对及系统发育树的绘制，鉴定为铜绿假单胞菌，并命名为Pseudomonasaeruginosa N1207。 (2)模拟空间条件诱变。利用强磁场重力梯度环境模拟空间条件诱变P.aeruginosaN1207，从9个不同磁场和重力下筛选出31株正向突变株，最终筛得一株最佳正突变株，命名为P.aeruginosa M14808。强磁场重力梯度模拟空间条件诱变实验结果表明:菌株产生诱变可能是磁场与重力共同作用的结果，但强磁场在诱导菌株突变中起主要作用;比较原始菌株与正突变株的生长曲线发现，正向突变株的对数生长期提前了4～5 h，而到达衰亡期的时间几乎相同;P.aeruginosa M14808传代培养6代产量稳定，较原始菌株产量提高30％左右。 (3)P.aeruginosa M14808摇瓶发酵条件优化。对P.aeruginosa M14808的发酵培养基及发酵条件进行单因素优化，确定最佳碳源、氮源分别为葵花籽油和NaNO3，其最佳比例为6∶1，发酵温度范围为34～38℃，初始pH值范围为5.0～7.0，发酵时间为12～16d;在单因素实验基础上，选取初始pH值、发酵温度和发酵时间三个关键影响因素，以鼠李糖脂产量为响应值，利用Design-Expert7.0 Trail软件中Box-Behnken设计(BBD)进行响应面优化，建立P.aeruginosa M14808代谢鼠李糖脂的三元二次回归模型，最优发酵条件为:初始pH值为6.33、发酵时间为14.14 d、发酵温度为36.20℃。采用该最优发酵条件，鼠李糖脂产量为21.78 g/L。 (4)P.aeruginosa M14808发酵动力学研究。利用瑞士比欧3.7 L发酵罐，通过代谢调控研究P.aeruginosa M14808分批发酵产鼠李糖脂过程。采用GraphPad Prism软件，以Logistic、Luedeking-Piret等方程为基础，建立了P.aeruginosa M14808发酵过程中菌体生长、鼠李糖脂合成和基质消耗与时间的动力学模型方程;所建模型拟合度较好，一定程度上揭示了P.aeruginosa M14808发酵代谢的动力学特征，可用来预测发酵体系中菌体浓度、产物浓度、基质浓度，判断发酵过程的优劣，制定发酵工艺参数，实现发酵过程的优化控制。 (5)P.aeruginosa M14808代谢产物的分离纯化及结构表征。发酵液采用萃取、柱层析组合分离、纯化并结合表观分析和TLC检测，代谢产物确定为色素、脂肽、糖脂和中性脂。在此基础上，通过质谱、二级质谱及傅里叶红外等表征方法，结合相关文献报道，确定:色素为绿脓菌素，分子式为C13H10N2O;19种单、双鼠李糖脂，主要分别为RhC10C10和Rh2C10C10;6种脂肪酸。通过傅里叶红外对特征官能团的分析确定脂肽组分。 (6)P.aeruginosa M14808代谢产物的活性研究。各代谢产物对病原菌均有一定抑制作用，绿脓菌素的抑菌效果最为显著，脂肽的抑菌效果优于双鼠李糖脂，单鼠李糖脂效果较差;各代谢产物对肿瘤细胞抑制效果不一，绿脓菌素、单鼠李糖脂对肝癌细胞HepG2抑制效果最为显著，双鼠李糖脂对乳腺癌细胞MCF-7抑制效果最为明显，脂肽对肺癌细胞A549抑制效果最为显著;AO/EB细胞染色和细胞活体在线培养实验结果表明:绿脓菌素和脂肽促使HepG2和A549肿瘤细胞凋亡，而双鼠李糖脂导致MCF-7细胞坏死;根据DNA ladder、caspase3及凋亡相关基因检测的实验结果进一步确认双鼠李糖脂导致MCF-7细胞坏死而非凋亡。 (7)绿脓菌素抑制肿瘤细胞增殖机理研究。绿脓菌素对HepG2和A549两株肿瘤细胞的生长、增殖有影响;氧化应激参数检测发现，绿脓菌素可刺激肿瘤细胞产生大量ROS，抗氧化酶SOD、CAT显著增加，而抗氧化物GSH及GSH/GSSG降低显著，说明绿脓菌素可导致氧化应激的发生;根据SA-β-Gal、caspase3、彗星实验及凋亡相关基因检测结果，推测绿脓菌素抑制肿瘤生长、增殖的机制为:绿脓菌素刺激肿瘤细胞产生大量ROS，胞内氧化与抗氧化系统失衡，导致氧化应激的发生，促使细胞加速衰老和凋亡，从而抑制了肿瘤细胞的生长和增殖。