乙肝病毒癌基因HBx与细胞癌基因RMP的协同致癌作用及其分子机制

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目的:通过乙肝病毒癌基因HBx与细胞癌基因RMP在HepG2肝癌细胞株中的共表达,探索HBx与RMP的协同致癌作用,探讨两者在协同导致肝癌发生和发展中的分子机制。方法:1.CCK-8检测HBx和RMP对肝癌细胞增殖的影响。2. qRT-PCR和Western blot检测HBx和RMP在肝癌细胞中的表达。3.流式细胞术检测各组细胞凋亡及细胞周期的改变。4. qRT-PCR和Western blot检测各组细胞凋亡和周期相关基因及蛋白的表达。5.彗星电泳检测各组细胞DNA损伤的改变。6.裸鼠皮下移植瘤实验,观察HBx和RMP对移植瘤生长的影响;7.HE染色观察裸鼠移植瘤细胞形态学变化,免疫组化法检测移植瘤组织中HBx、RMP、AFP、Bcl-2、Bax和Bad蛋白的表达。8.免疫组化法检测人肝癌组织及癌旁组织HBx和RMP的表达9. qRT-PCR和Western blot检测HBx剂量效应对内源性RMP表达的影响。10.共聚焦激光扫描显微镜观察HBx和RMP在细胞内的定位情况。11.免疫共沉淀探讨HBx和RMP在细胞内的结合情况。结果:1.CCK-8检测细胞增殖,结果显示HBx和RMP共表达可以促进肝癌细胞的增殖。2. qRT-PCR和Western blot检测HBx和RMP在HepG2细胞中的mRNA和蛋白成功共表达。3.流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期的改变,显示HBx和RMP共表达可以抵抗辐照引起的细胞凋亡和G2/M期阻滞。4. qRT-PCR和Western blot检测各组细胞凋亡和周期相关基因及蛋白的表达,显示HBx和RMP共表达可能通过下调凋亡基因p53、Caspase-3、Bax和上调抗凋亡基因Bcl-2的表达实现对细胞凋亡的抵抗,上调Cyclin B和CDK1和下调p21的表达实现对G2/M期的阻滞。5.彗星电泳结果显示RMP对急性DNA损伤有良好的抵抗效应。6.裸鼠皮下移植瘤实验结果显示HBx和RMP共表达能促进移植瘤生长加快。7.HE染色显示HBx和RMP共表达的移植瘤细胞增殖增多,免疫组化结果显示AFP、Bcl-2表达量显著升高,Bax、Bad表达显著降低。8.免疫组化法检测人肝癌组织HBx和RMP的表达高于对应的癌旁组织。9.HBx剂量效应结果显示RMP与HBx在表达量上无直接相互影响。10.共聚焦激光扫描显微镜观察HBx与RMP在细胞内主要分布在胞浆并有部分的定位重合。11.免疫共沉淀结果显示HBx与RMP在细胞内有部分能结合形成复合体。结论:1.HBx和RMP能协同促进肝癌细胞增殖,协同抵抗60Coγ射线照射引起的细胞凋亡和G2/M期阻滞,影响细胞凋亡和周期相关关键因子的表达,能促进体内移植瘤的形成及生长,促使肿瘤细胞走向存活,进而两者可能在肝癌发生发展过程中起着重要的作用。2.HBx和RMP在表达量上无直接相关性,但在细胞内能共同定位及相互结合形成复合物,提示这种结合关系可能在引起两者协同致癌的作用中至关重要。
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