论文部分内容阅读
研究背景在20世纪70年代,斑马鱼作为模式生物首次进入人们的视野。斑马鱼具有体积小、繁殖快、易于养殖、生命周期短、体外受精及发育、胚胎透明等众多独特的生物学优势,并且其与人类基因的同源性高达87%。凭借这些特点,斑马鱼作为新兴的模式生物,迅速成为越来越多科学研究者的新宠。近年来,随着相关生物学技术的不断发展与完善,斑马鱼在各个研究领域的应用模型也逐步建立起来。比如药物筛选与安全评估模型、免疫系统模型、微生物侵染模型、心血管发育与疾病模型、白血病模型以及组织再生模型等。这些模型的建立为相关疾病发生机制和防治手段的研究提供了极大的便利。造血是指血液中各种血细胞的生成、发育与成熟,它是从胚胎发育时期就开始的,贯穿生物体一生,持续不断地产生并补充血液系统的过程。成熟血细胞包括红细胞、巨核细胞、血小板、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤(nature killer, NK)细胞。各种血细胞对机体正常生理功能的维持均具有重要作用,例如红细胞具有运氧功能,白细胞参与机体炎症和防御反应,淋巴细胞参与免疫反应等。目前,人们已发现多种恶性疾病与血细胞发育缺陷密切相关,比如各类贫血、白血病和恶性淋巴瘤等等。因此,研究造血发育能够帮助人们更深入地理解这些血液相关疾病的发生过程及机理,从而为临床诊断及治疗提供指导意义。脊椎动物的造血发育大致可分为两个阶段：原始造血阶段和定向造血阶段。原始造血的主要作用是产生能够为机体提供氧气的红细胞,以满足早期胚胎快速生长的需要。定向造血出现在发育阶段的晚些时期,其显著特点是随着发育时间的改变,其位置也发生相应的变化。定向造血阶段生成造血干细胞,它具有多能性,能够分化产生机体所需的全部谱系的血细胞。在脊椎动物中,定向造血阶段的HSCs主要来自于胚胎的主动脉-性腺-中肾区域,随后,它们迁移至胎肝,最终进入骨髓,为机体终生造血。斑马鱼中的造血发育过程与哺乳动物十分相似,同样包含原始造血和定向造血两个阶段。由腹侧中胚层形成的中央细胞群是产生原始红系祖细胞的组织,而前部侧向中胚层被认为是原始髓系造血的位点。在受精后30h,在背主动脉腹侧壁区域开始产生造血干细胞,标志着定向造血阶段的开始,这些造血干细胞随后逐渐迁移至尾部造血组织,最后定居在肾脏,为机体终生造血。造血发育是一个复杂有序的动态过程,受到多个转录因子的调控。原始造血过程主要由Gatal和Pu.1两个调控因子所调控,它们之间呈现出相互拮抗的关系,共同调节原始红系和髓系的命运分化。其中Gatal标记原始红系造血,而Pu.1则标记原始髓系造血。在定向造血阶段主要的调控因子有Runxl和Cmyb等,它们同时也是造血干细胞的标记物。此外,其他的造血发育阶段标记基因还包括标记定向红系造血的ael和βe1,标记定向髓系造血的lcp1,特异性标记中性粒细胞的mpx和lyz,特异性标记巨噬细胞的mfap4和mpegl,以及标记定向淋系造血的gata3、ikaros、rag1和rag2等。髓系过氧化物酶(MPO)早在20世纪40年代便被发现,然而直到多年之后,其功能才逐渐被人们所认知。MPO是哺乳动物血红素过氧化物酶家族成员之一,主要储存在中性粒细胞的初级颗粒中。当机体遭受损伤或微生物入侵时,MPO从中性粒细胞的颗粒中释放出来,发挥免疫作用。通常,人们认为MPO的主要功能是通过产生活性氧,特别是次氯酸,从而发挥其杀菌作用。体外实验已经清楚地证明,MPO及其底物H202和卤素能够组成一个强有力的抑制并杀灭细菌和真菌的系统。近年来,随着人们对MPO了解的不断深入,越来越多的证据表明MPO的功能不仅仅局限于杀菌,而是更为广泛。MPO同样参与细胞内的稳态调节,并且在多种炎症疾病的发生和形成过程中发挥重要作用。由于MPO能够参与机体内多个生化过程,从而发挥各种不同的生物学功能,因此MPO与多种人类疾病的产生和发展都有着较为密切的关系。MPO缺陷病人在机体免疫能力低下的情况下更容易受到各类微生物,尤其是白色念珠菌的感染,从而引发全身性感染疾病。MPO还和多种免疫反应和慢性炎症疾病有关。大量临床研究表明,MPO与各种心血管疾病,特别是动脉粥样硬化的形成密切相关。此外,MPO介导的氧化作用所引起的组织损伤在其他慢性炎症疾病的发展过程中也发挥重要作用。在斑马鱼中,髓系过氧化物酶(mpx)基因主要作为中性粒细胞的特异性标记基因,用来研究中性粒细胞的生成、发育和迁移运动。然而对于其本身的功能,尤其是杀菌功能的研究却少之又少。本研究首先通过化学诱变剂ENU诱变处理野生型AB斑马鱼雄鱼(F0代),使其精原细胞发生随机的基因突变,进而繁殖产生F1代及F2代。我们通过对F2代同家族自交产生的F3代胚胎进行造血发育相关的表型检测,从中筛选出具有特定造血发育缺陷表型的突变体。接着,我们选择一种具有苏丹黑B染色阴性表型的突变体smu681进行定位克隆,找到了其突变基因mpx,同时进行了初步的表型鉴定。最后,我们对突变体smu681进行白色念珠菌侵染实验,通过分析其侵染后的各种表型,以期能够对髓系过氧化物酶的杀菌功能有更深入的了解。本文研究内容总共分为三个部分：第一部分为斑马鱼造血突变体的大规模筛选；第二部分为突变体smu681的突变基因定位克隆及表型鉴定；第三部分为突变体smu681的白色念珠菌侵染实验。第一部分：斑马鱼造血突变体的大规模筛选1.目的本部分的研究主要是利用ENU诱变处理斑马鱼使其产生随机突变,进而通过不同的表型检测方法从中筛选出具有特定造血发育缺陷表型的突变体,并对其进行初步的分类,以用于后续进一步的研究工作。2.方法我们采用常规的ENU诱变方法,处理40条野生型AB斑马鱼雄鱼,将处理后仍存活的雄鱼与野生型AB雌鱼交配产生F1代,进而繁殖F2代。收集F2代同家族自交产生的F3代胚胎,分别通过中性红染色、苏丹黑B染色和原位杂交三种不同的表型鉴定方法,筛选出造血发育缺陷的突变体。3.结果1)经过4轮诱变处理后,仅有20条雄鱼存活下来。将存活的雄鱼与野生型AB雌鱼交配,培养了20个家族,总数约2000条的F1代斑马鱼。进而将F1代与野生型AB交配,总共培养了1564个F2家族。2)我们成功筛选了1383个F2家族,共得到52个突变体,经过互补实验进一步分为25种。根据其表型可初步分为4个类型,其中,中性红染色缺失突变体有5种,苏丹黑B染色突变体有2种,中性红和苏丹黑B染色同时缺失的突变体有1种,βe1基因表达缺失突变体有17种。这些突变体将在以后进行详细的基因和功能方面的研究。第二部分：突变体smu681的突变基因定位克隆及表型鉴定1.目的本部分的研究目的是通过定位克隆找到突变体smu681的突变基因,进而找到其具体的突变位点。随后对突变体smu681进行较为详细的表型鉴定,同时通过拯救实验进一步验证突变基因与表型的对应关系。2.方法我们采用常规的斑马鱼定位克隆的方法,首先构建专门用于基因作图的家族,大量收集突变体胚胎,接着依次进行定位染色体的初步作图和定位基因的精确作图,最终找到突变基因及其突变位点。根据突变位点的序列特征设计基因型鉴定的方法,以便能够清楚区分野生型、杂合突变体和纯和突变体三种不同的基因型。我们通过苏丹黑B染色、二氨基联苯胺染色和酪氨酸信号放大染色三种不同的方法分别检测突变体smu681的髓系过氧化物酶催化活性,利用原位杂交和荧光定量PCR技术来检测突变体smu681中包括mpx基因在内的各谱系造血发育标记基因的表达情况。我们分别用显微注射法直接导入mRNA和构建稳定表达转基因品系两种方法来进行smu681的拯救实验。3.结果1)初始作图的结果将突变体smu681的突变基因定位于斑马鱼10号染色体上,精确作图将其进一步确定为mpx基因。通过对smu681的mpx基因进行全长测序,发现其突变点位于第13个外显子上,为三个碱基的缺失,其突变类型为无义突变,即产生了使得翻译提前终止的终止密码子。2)三种不同的针对髓系过氧化物酶催化活性的染色结果均表明,在突变体smu681的中性粒细胞内,髓系过氧化物酶的活性几乎完全缺失。3)原位杂交和荧光定量PCR的结果表明,在受精后24h、36h、48h和72h这四个不同的时期,突变体smu681中mpx基因的mRNA水平远远低于正常情况。同时smu681的Tg(mpx:GFP)转基因品系能够正常表达绿色荧光,说明其转录活性未受影响。4)我们分别检测了各谱系造血的代表性标记基因在smu681中的表达,分别是：标记原始髓系造血的pu.1,标记原始红系造血的gatal,标记定向造血干细胞的c-myb,标记中性粒细胞的lyz,标记巨噬细胞的mfap4,标记定向红系造血的βe1,标记定向淋系造血的ragl。原位杂交结果显示这些标记基因在smu681中均能正常表达,提示突变体smu681的其他谱系造血发育基本正常。同时特别检测了中性粒细胞特异性标记基因npsn和srgn的表达,以及观察了smu681的Tg(lyz:DsRED2)的荧光表达情况,结果证明中性粒细胞的产生及数量未受影响。5)拯救实验的结果表明,直接注射mpx基因的mRNA虽然能够使其在突变体胚胎内表达,但由于其表达时间短暂,表达位置过于广泛,因此不足以起到恢复表型的效果。而使mpx基因在髓系特异性启动子coronin1a驱动下表达的稳定转基因品系则能够一定程度上恢复突变体的表型。第三部分：突变体smu681的白色念珠菌侵染实验1.目的本部分研究的主要目的是通过对突变体smu681进行白色念珠菌的侵染实验,从而分析其遭受侵染后的各种表型,进而研究髓系过氧化物酶在真菌侵染过程中所发挥的作用。2.方法我们通过显微注射法,将表达绿色荧光的白色念珠菌注射到斑马鱼胚胎的后脑室以实现侵染效果。我们分别使用三种不同剂量的白色念珠菌进行侵染实验,通过激光共聚焦显微镜观察胚胎内白色念珠菌的生长状况,以及记录侵染后胚胎的存活率,来评估白色念珠菌的侵染效果,并比较突变体smu681和野生型是否有所不同。我们收集真菌侵染后不同时间点的胚胎,匀浆涂板,从而进行菌落计数,以此评估侵染后不同时期胚胎内白色念珠菌的存活数量。我们通过转基因品系斑马鱼Tg(lyz:DsRED2)来观察并追踪真菌侵染后不同时期的胚胎内中性粒细胞在后脑的聚集数量,并且通过荧光定量PCR检测IL-1βmyd88和IL-8三个炎症因子基因的表达水平,从而比较突变体smu681和野生型在遭受真菌侵染后内部的炎症反应程度。3.结果1)通过不同剂量的真菌注射后胚胎存活情况的对比,发现高剂量真菌注射会使得全部胚胎在侵染后30h内死亡;中等剂量注射也会引起大部分胚胎出现严重感染并死亡,其过程比高剂量要慢；而低剂量注射则不会引起感染,且胚胎能够在侵染后存活超过4天。对比突变体smu681和野生型胚胎,并未发现二者在真菌侵染后的生存率上有明显的区别。2)白色念珠菌的菌落计数结果表明,侵染后24h和48h,突变体smu681胚胎内部的真菌数量要多于野生型,而到了72h,二者数量接近。这提示髓系过氧化物酶活性的缺失对于侵染早期机体内抑制白色念珠菌的生长繁殖产生了一定的影响。3)通过观察真菌侵染后的胚胎后脑部位聚集的中性粒细胞数量,我们发现突变体smu681胚胎中所聚集的中性粒细胞数量要多于野生型,表明其内部的炎症反应程度更为严重。4)通过检测侵染后IL-1β、myd88和IL-8三个炎症因子的表达水平,我们发现,在侵染后的突变体smu681胚胎中,IL-1β和IL-8都出现了比起野生型更为明显的上调,而myd88所受影响相对较小。这提示髓系过氧化物酶的缺失会引起IL-1β更为强烈的表达,进而引起其下游基因IL-8的上调,从而导致更多的中性粒细胞在侵染部位的聚集。全文结论1)我们通过ENU化学诱变,成功筛选到25种斑马鱼造血缺陷突变体,并根据其表型初步分为4个类型。这表明ENU诱变筛选是一种成熟且高效的正向遗传学筛选方法,这些突变体将在我们今后对于造血发育的研究中起到十分重要作用,并且有望建立起相应的疾病模型。2)我们通过对突变体smu681进行定位克隆,发现其突变基因为mpx。表型分析显示smu681内部的Mpx催化活性几乎完全缺失,而其造血发育却基本不受影响,同时也能够正常生长发育。这说明smu681是一种非常特异的髓系过氧化物酶缺陷突变体,适合用来进行针对Mpx活性的功能研究。3)通过对突变体smu681进行白色念珠菌侵染实验,我们发现其侵染后胚胎的存活率与野生型相差不大,但是其内部真菌生长数量明显较多。进一步研究发现,突变体smu681的侵染部位往往有更多的中性粒细胞聚集,同时相关炎症因子的表达也更为强烈,表明其炎症反应更加严重。