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利用本课题组合成的阳离子类脂,加入不同助剂制备阳离子脂质体。分析其与质粒的结合能力以及复合物形态。进行细胞的体外转染,研究转染效率和细胞毒性。
采用薄层分散和超声法制备阳离子脂质体。琼脂糖凝胶电泳分析阳离子脂质体与质粒pGFP-N2(报告基因)DNA的结合能力,原子力显微镜检测复合物的形态。以商品试剂Lipofectamine2000为对照,利用脂质体/DNA复合物转染MCF-7细胞和HeLa细胞,荧光显微镜观察其基因转染效率。进行了转染条件优化,利用MTT法评价转染试剂的毒性。原子力显微镜分析表明,脂质体/DNA复合物颗粒的表面不光滑,有一定的黏连性,能较规律的分散在云母片上。而壳聚糖修饰脂质体/DNA复合物颗粒的表面相对光滑。加入少量或等量DOPE,延滞DNA能力增强,DOPE量多时反而减弱;加入蔗糖酯延滞能力变化不明显;壳聚糖修饰的脂质体,延滞DNA的能力明显增强。加入蔗糖酯后,转染效率下降;添加DOPE后,转染效率升高;壳聚糖修饰的脂质体转染效率明显提高。
壳聚糖修饰脂质体最佳转染条件为:壳聚糖与质粒比例为8:1、复合物形成时间45min、细胞汇合度80%。在此条件下,对HeLa细胞的转染效率达到70%以上,且细胞毒性较低。在血清存在的情况下,对MCF-7细胞转染效率影响不大。
壳聚糖修饰脂质体作为基因载体具有很好的应用前景。