论文部分内容阅读
斜纹夜蛾(Spodoptera litura)是一种常见的鳞翅目夜蛾科害虫，具有强大的迁飞力和繁殖力。目前，针对夜蛾科害虫的防控措施有生态调控及天敌保护利用、成虫诱杀、生物制剂、化学药物等。长期以来，基于信息素诱捕、生物杀虫剂和遗传操作等生物防治策略，巧妙地利用了鳞翅目生活习性或特有的基因。Osiris基因家族属于昆虫纲特有基因家族，首次发现于果蝇(Drosophila melanogaster)Triplo-lethal(Tpl)位点处，此位点具有单倍体或三倍体致死效应和杀虫剂敏感性，因此Osiris基因可作为害虫防治的潜在靶标基因。本研究利用生物信息学鉴定分析了斜纹夜蛾Osiris基因家族，用RT-PCR、Westernblot、免疫荧光、RNAi等技术重点研究了Osiris9基因家族在蛹期翅膀的表达模式及功能。主要研究结果如下：
1、斜纹夜蛾Osiris基因家族鉴定及表达模式分析
利用生物信息学，在斜纹夜蛾基因组中鉴定了26个Osiris基因家族成员，除了Osiris22、Osiris21和Osiris23分别位于7、15和21号染色体上，其余23个基因串联分布于24号染色体，定位于4051237到11991034区域。Osiris基因成员的氨基酸长度、外显子数目均不同。Osiris蛋白高度保守，主要有跨膜结构域、DUF1676结构域、AQXLAY基序和信号肽等。分析果蝇(Drosophila melanogaster)、黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、家蚕(Bombyx mori)、小菜蛾(Plutella xylostella)、红带袖碟(Heliconius melpomene)、西方蜜蜂(Apis mellifera)等的Osiris基因家族进化关系。结果显示，非鳞翅目昆虫Osiris9是单拷贝，鳞翅目昆虫Osiris9为6个拷贝，高度保守，表明Osiris9基因在鳞翅目昆虫中特异扩张。随后，采用RT-PCR，调查Osiris基因家族的表达模式，结果显示23个基因在胚胎后期高量表达。转录组分析显示Osiris9在表皮和蛹期翅膀表达，暗示鳞翅目特异扩张的Osiris9基因亚家族可能对昆虫变态期的发育起作用。
2、Osiris9基因家族在蛹期翅膀表达模式分析
斜纹夜蛾有极强的迁飞能力，翅膀对其生命活动至关重要，蛹期是翅膀形态发育的关键时期。因此，我们调查了斜纹夜蛾蛹期翅膀发育过程，结果显示翅膀初期为小而薄的囊泡，表面有少许发育不全的翅脉；第五天翅膀在尺寸上已经达到蛹期最大值，翅面有少许鳞毛；第七天翅脉延展发育，翅面覆盖大量鳞毛；第九天翅面被鳞毛完全覆盖，翅脉发育完全；羽化前，翅膀鳞毛颜色渐变至黑褐色，硬度达到成虫翅膀状态。采用RT-PCR，重点调查了鳞翅目特异扩张的Osiris9亚家族成员在蛹期翅膀的表达模式，结果显示在蛹5天仅5个Osiris9基因在翅膀高量表达，蛹9天翅膀仅2个基因有表达，表达趋势与转录组数据基本一致。将翅膀组织进行石蜡切片处理后，用HE染色后观察形态变化，结果显示在蛹5天翅面仅有少许鳞毛，到第9天翅面完全被鳞毛覆盖。根据翅膀发育形态学观察，发现第五天是翅脉形态发育关键时期，翅脉延展，鳞毛生长；第九天翅膀的鳞毛、翅脉均发育完全。对照基因表达模式和翅膀发育过程，推测Osiris9可能在翅膀发育过程中起作用。
3、斜纹夜蛾Osiris9基因家族的功能研究
为了研究斜纹夜蛾Osiris9基因簇在翅膀发育中的功能，采用RNAi实验，合成Osiris9簇的siRNA，根据其在蛹期翅膀的表达模式，用siRNA注射蛹体，观察羽化后成虫翅膀形态。与对照组成虫羽化正常相比，实验组约70%的成虫翅膀发育畸形，表型主要有3类：①卷曲型②鳞毛缺少型③无法正常羽化型。用荧光定量检测了RNAi后畸形翅膀中Osiris9基因亚家族的表达量，结果为Osiris9基因簇表达量显著下降。通过显微镜观察，正常翅鳞毛呈屋瓦型排列，疏密有致，翅脉粗细均匀，沿着翅膀方向笔直延伸；畸形翅透光度低于正常翅膀，翅面出现许多折痕且鳞毛杂乱，翅脉伸展方向凌乱，无法正常伸展。用软毛刷沿翅脉方向轻轻地去除正常翅和畸形翅的鳞毛，再次在显微镜下观察。发现正常翅膀的翅脉内膜与翅脉紧密相连，并沿着翅脉方向延伸；畸形翅膀的翅脉内膜与翅脉分离，向内不规则塌陷。由此推测，Osiris9基因簇表达量下降导致翅脉内膜发育异常，不能正常输送营养物质，导致翅膀发育异常。Osiris9基因簇具体如何调控翅膀发育的分子机制，还有待进一步研究。
1、斜纹夜蛾Osiris基因家族鉴定及表达模式分析
利用生物信息学，在斜纹夜蛾基因组中鉴定了26个Osiris基因家族成员，除了Osiris22、Osiris21和Osiris23分别位于7、15和21号染色体上，其余23个基因串联分布于24号染色体，定位于4051237到11991034区域。Osiris基因成员的氨基酸长度、外显子数目均不同。Osiris蛋白高度保守，主要有跨膜结构域、DUF1676结构域、AQXLAY基序和信号肽等。分析果蝇(Drosophila melanogaster)、黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、家蚕(Bombyx mori)、小菜蛾(Plutella xylostella)、红带袖碟(Heliconius melpomene)、西方蜜蜂(Apis mellifera)等的Osiris基因家族进化关系。结果显示，非鳞翅目昆虫Osiris9是单拷贝，鳞翅目昆虫Osiris9为6个拷贝，高度保守，表明Osiris9基因在鳞翅目昆虫中特异扩张。随后，采用RT-PCR，调查Osiris基因家族的表达模式，结果显示23个基因在胚胎后期高量表达。转录组分析显示Osiris9在表皮和蛹期翅膀表达，暗示鳞翅目特异扩张的Osiris9基因亚家族可能对昆虫变态期的发育起作用。
2、Osiris9基因家族在蛹期翅膀表达模式分析
斜纹夜蛾有极强的迁飞能力，翅膀对其生命活动至关重要，蛹期是翅膀形态发育的关键时期。因此，我们调查了斜纹夜蛾蛹期翅膀发育过程，结果显示翅膀初期为小而薄的囊泡，表面有少许发育不全的翅脉；第五天翅膀在尺寸上已经达到蛹期最大值，翅面有少许鳞毛；第七天翅脉延展发育，翅面覆盖大量鳞毛；第九天翅面被鳞毛完全覆盖，翅脉发育完全；羽化前，翅膀鳞毛颜色渐变至黑褐色，硬度达到成虫翅膀状态。采用RT-PCR，重点调查了鳞翅目特异扩张的Osiris9亚家族成员在蛹期翅膀的表达模式，结果显示在蛹5天仅5个Osiris9基因在翅膀高量表达，蛹9天翅膀仅2个基因有表达，表达趋势与转录组数据基本一致。将翅膀组织进行石蜡切片处理后，用HE染色后观察形态变化，结果显示在蛹5天翅面仅有少许鳞毛，到第9天翅面完全被鳞毛覆盖。根据翅膀发育形态学观察，发现第五天是翅脉形态发育关键时期，翅脉延展，鳞毛生长；第九天翅膀的鳞毛、翅脉均发育完全。对照基因表达模式和翅膀发育过程，推测Osiris9可能在翅膀发育过程中起作用。
3、斜纹夜蛾Osiris9基因家族的功能研究
为了研究斜纹夜蛾Osiris9基因簇在翅膀发育中的功能，采用RNAi实验，合成Osiris9簇的siRNA，根据其在蛹期翅膀的表达模式，用siRNA注射蛹体，观察羽化后成虫翅膀形态。与对照组成虫羽化正常相比，实验组约70%的成虫翅膀发育畸形，表型主要有3类：①卷曲型②鳞毛缺少型③无法正常羽化型。用荧光定量检测了RNAi后畸形翅膀中Osiris9基因亚家族的表达量，结果为Osiris9基因簇表达量显著下降。通过显微镜观察，正常翅鳞毛呈屋瓦型排列，疏密有致，翅脉粗细均匀，沿着翅膀方向笔直延伸；畸形翅透光度低于正常翅膀，翅面出现许多折痕且鳞毛杂乱，翅脉伸展方向凌乱，无法正常伸展。用软毛刷沿翅脉方向轻轻地去除正常翅和畸形翅的鳞毛，再次在显微镜下观察。发现正常翅膀的翅脉内膜与翅脉紧密相连，并沿着翅脉方向延伸；畸形翅膀的翅脉内膜与翅脉分离，向内不规则塌陷。由此推测，Osiris9基因簇表达量下降导致翅脉内膜发育异常，不能正常输送营养物质，导致翅膀发育异常。Osiris9基因簇具体如何调控翅膀发育的分子机制，还有待进一步研究。