论文部分内容阅读
[目的]筛选并获得C57BL/6小鼠衰老模型;利用衰老模型评价人的脐带间充质干细胞(hUCMSC)对衰老小鼠老年性器官功能退变的治疗作用;制备hUCMSC来源外泌体和HUVEC衰老氧化应激细胞模型,利用细胞模型评价hUCMSC来源外泌体在hUCMSC延缓或逆转衰老中的抗氧化应激作用及其机制,为hUCMSC治疗老年退变性疾病提供理论基础。[方法]1、hUCMSC的制备组织块直接贴壁法培养hUCMSC,倒置显微镜观察细胞状态,流式细胞仪检测hUCMSC细胞表面标志物,hUCMSC成脂、成骨和成软骨诱导分化实验鉴定其多向分化能力。体外通过表达GFP慢病毒转染标记hUCMSC,并通过荧光计数显微镜GFP标记阳性率。2、小鼠衰老模型筛选与评价常规饲料喂养C57BL/6小鼠至72周,共得60只老年鼠,根据小鼠毛色、身体活动力、精神状态、大便情况观察以及体重检测的方法进行筛选,按照毛色光泽度发暗,出现白色毛发,精神状态欠佳,活动减少、久坐,便干或者便稀频率增加,体重在(20±5)g范围的标准,将符合该标准的老年鼠纳入本实验,作为自然衰老小鼠模型,共40只,雌雄各20只;利用观察年轻小鼠一般情况,毛色发黑、发亮、顺滑,活动较多,精神饱满、饮食正常、大便正常,体重在(15±2.5)g范围的标准随机选取年轻小鼠20只,为年轻组。随机取年轻鼠(8w)与老年鼠(72w)各8只,为年轻组与模型组,对比评价模型组自然衰老小鼠的一般情况;心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏主要器官HE染色后观察组织结构变化,以及免疫组化检测p16、p53、SOD2和Catalase衰老相关蛋白在模型小鼠重要器官(心、肝、脾、肺、肾)中的表达水平;qPCR检测p16、p53、SOD2和Catalase等衰老相关蛋白在模型小鼠重要器官(心、肝、脾、肺、肾)中的转录水平,以及组织匀浆中总SOD活力。3、分组及hUCMSC移植将衰老小鼠随机分为实验组和对照组,各16只;实验组按照1×107个/kg的标准,经尾静脉输入GFP基因标记的hUCMSC,每只2×105个、200ul体积,每周1次,连续4次;对照组输入等体积生理盐水。常规饲养,移植4w后观察评价。4.hUCMSC移植疗效与机制评价hUCMSC移植结束1个月后分别比较两组小鼠的一般情况、脱颈处死后利用组织切片观察重要器官(心、肝、脾、肺、肾)结构差异以及qPCR、免疫组化分别检测衰老相关基因(p16、p53、SOD2和Catalase)在各重要器官中转录水平和表达水平的差异;检测两组小鼠组织匀浆中总SOD活力差异以及qPCR检测主要脏器组织(心、肝、脾、肺、肾)中自噬相关基因(becline1,LC3b,sirt1,sirt5)水平的差异。5.外泌体的制备与鉴定利用超高速离心法获得纯化hUCMSC来源外泌体,3%磷钨酸染色电镜观察外泌体形态,Western Blot检测外泌体阳性标志物HSP90、HSP70、CD63和阴性标志物TAPA。6.机制研究利用400nmol/L H202处理HUVEC细胞构建HUVEC衰老细胞氧化应激模型,并建立与hUCMSC的transwell共培养体系,Western Blot检测LC3a/b、mTOR和p-mTOR蛋白水平,共聚焦显微镜观察细胞模型自噬流,透射电子显微镜检测自噬泡形成情况,评价hUCMSC抗氧化应激效果。建立hUCMSC来源的外泌体与细胞衰老模型共培养体系,CCK8法检测外泌体对衰老HUVEC细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western Blot检测LC3a/b、p62自噬相关蛋白水平以及外泌体对衰老HUVEC细胞重要信号转导通路的激活情况。[结果]1、hUCMSC的制备组织块直接贴壁法培养hUCMSC 5天后可见细胞爬出,传至第三代后细胞呈长梭形并且具有典型的涡旋式生长特征;第三代hUCMSC表达间充质干细胞阳性标记物CD29和CD44的表达率为97.1%、99.6%,间充质干细胞阴性标志物CD34、CD45和CD105表达率为3.18%、0.04%、0%;成脂诱导分化10天后饱和油红O染色为阳性,成骨诱导分化3周后,茜素红染色阳性;成软骨诱导4周后,阿尔新蓝染色阳性,免疫组化可观察到GFP标记的细胞在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏。2、模型评价衰老模型小鼠(72w)与年轻小鼠(8w)相比身体活动力减少,毛色光泽度下降,出现白色毛发,精神状态欠佳,便干或者便稀频率增加;HE染色后可见不同程度的炎症浸润,细胞水肿、坏死,纤维组织增生等退行性变;免疫组化显示,衰老小鼠重要器官p16、p53表达水平,差异具有统计学意义(p<0.05),而SOD2和catalase低水平,差异具有统计学意义(p<0.05),组织匀浆中总SOD活性衰老组明显低于年轻组,差异具有统计学意义(p<0.05)。3、hUCMSC移植疗效评价hUCMSC移植后,实验组小鼠毛色光泽度提高,身体活动度增加,精神状态较好,大便异常率下降;器官组织结构有不同程度改善;免疫组化和qPCR检测p16和p53水平下降,差异具有统计学意义(p<0.05),而SOD2和Catalase水平上升差异具有统计学意义(p<0.05);小鼠组织匀浆中总SOD活性提高,差异具有统计学意义(p<0.05);主要脏器组织中自噬相关基因(becline1,LC3b)转录水平提高,差异具有统计学意义(p<0.05)。4、外泌体制备超高速离心分离所得hUCMSC源外泌体(hUCMSC-exo)呈立体的杯状结构,直径约136nm,外泌体标志性蛋白CD63、HSP90和HSP70高表达,而外泌体阴性标志物TAPA1不表达。5、hUCMSC的抗氧化应激作用机制评价H2O2处理HUVEC细胞后,细胞增殖能力下降,凋亡增加;经过与hUCMSC非接触共培养后,自噬标记物LC3a/b表达增加,电镜显示自噬小体及自噬流增加;经过与hUCMSC-exo共培养后,H2O2对HUVEC细胞增殖的抑制降低,HUVEC凋亡减少,自噬标记物LC3a/b表达增加,p62表达下降,细胞自噬泡明显增加,自噬抑制信号通路p38、mTOR、hsp27、stat3磷酸化水平下降,信号通路被抑制。[结论]1.正常饲养法饲养小鼠72w可获得具有衰老的一般特征及组织结构退行性改变的衰老小鼠模型。2.静脉注射hUCMSC,可以改善毛发、精神、活动、饮食以及体重状态生理状态和缓解组织结构病理状态;从分子水平hUCMSC能够抑制衰老基因的表达而促进抗氧化基因的表达,延缓或逆转机体氧化应激状态。因此,研究结果表明hUCMSC具有一定的治疗衰老退行性变的作用。3.hUCMSC的抗衰老作用可能是通过hUCMSC分泌外泌体通过调节多条信号转导通路促进衰老细胞自噬,清除衰老细胞中ROS,减少ROS引起的氧化损伤实现的。