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研究背景:慢性胰腺炎（Chronic pancreatitis,CP）增加胰腺癌的发病风险,胰腺纤维化是CP的主要病理特征之一。转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGFβ1）诱导胰腺星状细胞（Pancreatic stellate cells,PSCs）的活化和细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）合成,转化生长因子-β受体（Transforming growth factor-βreceptor,TGFβR）介导的Smad和non-Smad信号通路在纤维化疾病中扮演了重要的角色,热休克蛋白90（Heat shock protein 90,Hsp90）参与TGFβR稳定性的调控,细胞分裂周期蛋白37（Cell division cycle protein 37,Cdc37）作为热休克蛋白90（Heat shock protein 90,Hsp90）重要的辅助分子伴侣,Hsp90与Cdc37形成Hsp90/Cdc37复合体防止不稳定激酶降解。目前,Hsp90在CP中与胰腺纤维化的关系未见报道,Hsp90/Cdc37复合体在PSCs中与TGFβR介导的相关信号通路的关系尚不清楚,因此,本研究观察Hsp90与胰腺纤维化的关系,探索Hsp90/Cdc37复合体调控PSCs生物学功能的分子机制。第一部分血清热休克蛋白90α与慢性胰腺炎的关系目的:评估CP小鼠胰腺组织Hsp90的表达,观察血清Hsp90表达与CP的关系。方法:采用腹腔注射雨蛙素建立CP小鼠模型。取胰腺组织,石蜡包埋切片,石蜡切片行免疫组化染色,检测Hsp90在胰腺组织中的表达情况。提取胰腺组织蛋白,western blots检测胰腺组织Hsp90的表达。取外周血,western blots检测血清Hsp90的表达。结果:免疫组化染色表明,Hsp90在胰腺组织广泛表达。免疫组化染色和western blots显示,Hsp90在CP小鼠胰腺组织中高表达。Western blots结果表明,血清Hsp90α在CP小鼠中高表达。结论:血清Hsp90α在CP小鼠中升高,血清Hsp90α可能与CP相关,然而,基于该部分研究的局限性,目前的结论需要进一步确认。第二部分热休克蛋白90抑制剂17AAG改善慢性胰腺炎小鼠胰腺纤维化目的:观察Hsp90抑制剂17AAG在雨蛙素诱导CP小鼠中对胰腺纤维化的影响。方法:小鼠分为对照组、高剂量17AAG对照组,雨蛙素组、低剂量17AAG治疗组以及高剂量17AAG治疗组。取胰腺组织,石蜡包埋切片,石蜡切片行免疫荧光染色,检测胰腺组织炎症细胞和α-SMA的表达。提取胰腺组织RNA,q TR-PCR检测α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）、胶原蛋白（Collagen I,Col I）,纤维连接蛋白（Fibronectin,Fn）以及炎症因子的表达。提取胰腺组织蛋白,western blots检测α-SMA、Col I以及Fn的表达。结果:Hsp90抑制剂17AAG有效的减少了CP小鼠体重下降。q RT-PCR结果显示,炎症因子肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）,白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）以及白介素-6（Interleukin-6,IL-6）在CP小鼠胰腺组织中显著高表达,Hsp90抑制剂17AAG显著减少了这些炎症因子的表达。免疫荧光结果表明,CP小鼠胰腺组织出现大量中性粒细胞、T淋巴细胞以及巨噬细胞浸润,Hsp90抑制剂17AAG显著减少了CP小鼠胰腺组织中性粒细胞、T淋巴细胞以及巨噬细胞的浸润。α-SMA和SM22a免疫荧光双染提示,Hsp90抑制剂17AAG显著减少了α-SMA在CP小鼠PSCs中的表达,q RT-PCR和western blots结果表明,Hsp90抑制剂17AAG有效的减少了α-SMA、Col I和Fn在CP小鼠胰腺组织的表达。结论:Hsp90抑制剂17AAG通过减少CP小鼠胰腺组织炎症缓解CP所致的胰腺纤维化,Hsp90在CP中可能是未来抗胰腺纤维化治疗的新靶点。第三部分Hsp90/Cdc37复合体调控胰腺星状细胞活化和细胞外基质合成的分子机制目的:探索Hsp90/Cdc37复合体调控PSCs活化和ECM合成的分子机制。方法:提取原代PSCs,采用TGFβ1诱导的PSCs作为体外研究模型。提取细胞蛋白,western blots检测α-SMA、Col I以及Fn等蛋白的表达,免疫共沉淀实验检测Hsp90与TGFβRⅡ的相互作用。提取细胞RNA,q RT-PCR检测TGFβRⅡm RNA表达的影响。结果:Western blots结果表明TGFβ1在PSCs显著升高了α-SMA、Col I以及Fn的表达,Hsp90抑制剂17AAG显著抑制了TGFβ1诱导的α-SMA、Col I以及Fn的表达,Hsp90抑制剂17AAG在PSCs中对Hsp90的表达无明显影响。PI3K抑制剂wortmannin在PSCs中显著抑制了TGFβ1诱导的Akt和GSK-3β磷酸化。Hsp90抑制剂17AAG在PSCs中显著抑制了TGFβ1诱导的Smad2/3、Akt以及GSK-3β磷酸化。q RT-PCR结果表明,Hsp90抑制剂17AAG在PSCs对TGFβRII m RNA的表达无显著影响,western blots结果显示,17AAG在PSCs中显著抑制了TGFβ1诱导的TGFβRII的高表达。Celastrol是一种可以有效减弱Hsp90和Cdc37相互作用的特异性抑制剂,q RT-PCR结果表明,Celastrol在PSCs中对TGFβRII m RNA的表达无显著影响,western blots结果显示,Celastrol在PSCs中显著抑制了TGFβ1诱导的TGFβRII的高表达。蛋白酶体抑制剂MG132处理PSCs后,MG132阻止了Hsp90抑制剂17AAG对Smad2/3和PI3K/Akt/GSK-3β磷酸化的抑制作用,同时,MG132阻止了17AAG诱导的TGFβRII的降解。免疫共沉淀实验显示,Hsp90抑制剂17AAG在PSCs中减少了Hsp90与TGFβRII的相互作用,增加了泛素化的TGFβRII的表达,Celastrol在PSCs中减少了Hsp90/TGFβRⅡ的绑定。结论:Hsp90/Cdc37复合体通过泛素-蛋白酶体途径调控TGFβRⅡ介导的Smad和non-Smad信号通路影响PSCs的活化和ECM的合成。