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研究背景和目的：胎盘早剥（placental abruption，PA）是妊娠晚期严重并发症，也是导致围产儿死亡的最主要的原因之一，胎盘早剥增加了新生儿的发病率和死亡率，也被证实是出生低体重如小于胎龄儿的发生原因之一，国内杨建波等报道发病率为0.06％～2.1％，这部分新生儿中死亡率较高，高达20％～35％，15倍于无胎盘早剥者，苏丹的Wad Medani医院报道的PA的发病率占正常分娩的6.5％，其中死胎和出生后一个月的死亡率为20.2％，Salihu报道美国1995-1998年出生的1548.8万婴儿中单胎、双胎及三胞胎胎盘早剥的发生率不一致，各为6.2／1000、12.2／1000及15.6／1000，随着胎儿数量的增加，胎盘早剥的发生率增加。胎盘早剥母亲分娩的新生儿中，大多数会发生凝血功能障碍，而在严重的胎盘早剥以及其他严重的妊娠合并症中，高凝状态可以导致胎盘血栓形成，影响胎儿的凝血功能和生命安全，同样是该类新生儿较为潜伏而凶险的病理变化。体内的凝血过程由外源性凝血途径和内源性凝血途径构成，目前研究发现外源性凝血途径在病理性凝血的过程中发挥着主要的作用，，而组织因子作为外源性凝血途径的启动因子，与许多疾病包括胎盘早剥对新生儿凝血系统的影响方面有着密切相关。母亲羊水、胎盘、蜕膜及子宫肌层中含有明显高于血浆的组织因子，在分娩前的正常情况下，蛋白质、多肽能够通过出、入胞方式通过胎盘屏障，是由胎盘合体滋养层细胞表面的特殊受体决定，部分物质如激素类的蛋白质跨越母亲的胎盘屏障细胞间隙时，受到胎盘屏障上的酶类存在下被降解而不会产生生理效应，包括肽酶a酶类，来自母体的物质在通过胎盘屏障的机制方面，目前认为与母体面的血窦细胞滋养层及胎儿部分丛密的绒毛有关，胎盘可以选择性地允许某些大分子物质如IgG通过。胎盘早剥主要的病理改变是子宫的螺旋动脉断裂，其他的临近组织也同时受到损伤，Kuczynski报道在PA的胎盘和子宫肌层中含有显著高于血浆的TF，而TFPI的水平似乎很低，胎盘早剥发生时，其剥离处胎盘绒毛和蜕膜释放大量的组织因子，一方面这些凝血因子可能通过胎盘进入胎儿血液循环，影响胎儿及出生后的新生儿的凝血系统功能，另一方面由于损伤可能使胎儿体内凝血系统受到激活，使胎儿以及产出后的新生儿发生凝血功能障碍，严重时由于凝血酶的增加，使大量纤维蛋白原转为纤维蛋白，最后产生广泛性血管内凝血。我们的前期研究也发现，由于母亲PA所入院的新生儿中，一部分患儿是处于高凝状态，而重症产妇所生新生儿多数在入院时已处于低凝期或者纤溶期。母体由于调节机制较为完善，需要较多的促凝物质进入血循环才可引起严重的DIC，而胎儿机体小且调节机制不完善，只需要少量促凝物质即可引起严重DIC。对这些情况如果处理不及时，就会危及胎儿及新生儿的生命，造成死胎或者新生儿DIC。我们研究在PA时凝血因子组织因子和抗凝物质组织因子途径抑制物在母亲、脐血及新生儿血液中的变化，从而也了解在胎盘损伤时其两侧的这两种蛋白质分子是否存在差异，目前在国内外文献中尚未见报道。尽管在新生儿的这种高危状态下治疗是多方面的，但目前的治疗主要在被动地应用纤维蛋白原、血小板及其他凝血因子。在治疗这类出凝血性疾病时，设想通过瞬时关闭组织因子途径中组织因子的表达，达到短暂阻止凝血过程的启动，减少凝血因子和血小板的消耗，从而防治母亲胎盘早剥对新生儿凝血功能的影响。RNAi技术（RNA interference，RNAi）是一种可高效、特异地下调目标基因的表达并在基因功能研究和基因治疗领域有着广阔应用前景的技术。近年来进展主要集中在诱导特异性靶基因表达沉默、干扰信号传导通路、抑制艾滋病病毒基因和肝炎病毒基因、抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望成为这类疾病新的手段。我们设想应用RNAi技术瞬时关闭组织因子的表达，达到阻止凝血过程的启动，干扰病理性的凝血过程，从而减少胎盘早剥对新生儿凝血功能的影响，具有一定的临床实用意义。而脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVECs）由于便利和来源丰富在疾病研究方面存在很大的优势，主要集中在为出凝血疾病、组织学工程人工血管、动脉粥样硬化等方面的研究提供很好工具。我们在原代培养脐静脉内皮细胞的基础上，建立组织因子基因干扰载体系统，利用近年来发展起来的RNAi技术，分别对胎盘早剥和正常出生的新生儿脐静脉内皮细胞的组织因子表达进行干预，将构建的组织因子干扰载体转染进入脐静脉血管内皮细胞，沉默内皮细胞组织因子表达，为进一步的基因治疗打下基础。方法1、按照试剂盒说明书，采用Elisa方法以正常分娩作为对照，测定胎盘早剥产妇血、脐血及所生新生儿血TF、TFPI，并计算出TFPI／TF的值。2、HUVECs的体外培养和鉴定：无菌剪取刚分娩的脐带约10cm，挤去脐带血管中的血液，PBS反复冲洗掉脐带外及末端血迹，再用PBS 20～40ml持续冲洗脐静脉腔，至流出的液体无色或淡洗肉水色，0.1％胶原酶Ⅱ5～10ml，灌入脐静脉，37℃孵育消化12min，收集消化液再用PBS约20ml反复冲洗脐静脉，加入胎牛血清终止消化，将收集液1000r／min×10min，常温离心，弃上清，在收集细胞沉淀中加入完全培养基，反复吹打使细胞团成为单个细胞，接种至25cm2培养瓶中，37℃，5％CO2，培养24h后观察，见较多细胞贴壁伸展生长，成梭形或三角形，换液，再加入含有表皮生长因子（Edothenial grouth factor，EGF）培养48～72小时至细胞基本长满培养瓶，应用免疫组织化学法进行Ⅷ因子相关抗原鉴定，取第2、3代细胞用于实验。3、RNA干扰TF基因表达载体的构建与鉴定：利用网站https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress提供的免费在线软件设计两个位点TF基因的干扰序列T12和T6，合成siRNA序列，再行寡核苷酸双链（ds oligo）的合成，退火后形成的ds oligo双链连接到BLOCK-iTTM U6 RNAi Entry Vector试剂盒中的pENTRTM／U6载体的粘性末端，连接产物转化到感受态细胞，增菌，质粒感受态扩增，质粒DNA小提、测序，根据测序结果选择正确的转化体T12，将结果中的错配T6作为阴性对照进行下一步实验。4、RNAi沉默胎盘早剥胎儿脐静脉内皮细胞组织因子基因表达的研究本实验分为两个实验组，一个为正常组，一个是病理组，每个组设立三种处理方法：①空白未干扰对照；②假干扰对照；③RNAi干扰TF基因表达实验，每种实验方法各有三个样本。分别对这3种处理方法后HUVECs在基因沉默前后的mRNA表达、TF蛋白水平免疫荧光检查的变化进行观察，以探讨其在生物学功能方面的变化。（1）转染：按1ml／孔将5×104／ml HUVECs接种到24孔板中，待细胞生长至24孔板的60％～80％，每孔加入0.5μg质粒DNA，将构建载体转染至HUVECs，37℃孵育培养48小时；（2）RT-PCR检测：将24孔板中的细胞去上清，采用两步法进行RT-PCR检测测定mRNA第一步反应条件为42℃20min→95℃5min→5℃5min；人组织因子cDNA序列（NM001993）设计一对引物，上游引物的序列为5′-CCGGCACAGCTTTAACAACCT-3′；下游引物的序列为5′-CGTTTGCTCTCGATTCCATGTG-3′。选用人β-actin基因（CF62602）作内参照，扩增β-actin基因的上游引物序列为：5′-TGGCACCACACCTTCTACAATG-3′；下游引物的序列为：5′-CCGTGGTGGTGAAGCTGTAGC-3′。PCR反应条件为：94℃5min→32×（94℃30s，50℃30s，72℃30s）→72℃5min。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，Bio-rad凝胶成像系统成像，Gel-Pro Analyzer软件对上述结果进行区带灰度值扫描并分析，用所测定得到的TF和beta-actin的扩增带的密度比值表示TF的相对表达强度。（3）TF表达的免疫荧光检查：将1×1cm大小无菌盖玻片放入242孔板中，按5×104／ml密度接种HUVECs制作细胞爬片，待细胞生长至24孔板的60％～80％，按照上述步骤将构建载体转染至HUVECs，去上清，PBS浸泡，室温干燥后，多聚甲醛室温固定，兔抗人TF抗体（工作浓度为1：200），湿盒孵育，PBS清冼3次后加入FITC标记的羊抗兔二抗（工作浓度为1：400），孵育2hr，荧光显微镜下观察。结果1、PA组母亲较正常分娩母亲血浆TF测定值升高，有显著性差异，P＜0.05，PA组脐血较正常分娩脐血TF测定值升高，有显著性差异，P＜0.01，PA组胎儿脐血较PA组新生儿血及母亲血TF测定值升高，但差异没有显著性，P＞0.05；PA组母亲血浆较正常分娩母亲TFPI测定值降低，存在显著性差异，P＜0.01。PA组脐血较正常分娩脐血TFPI测定值降低，有显著性差异，P=0.01，PA病理母亲血浆TFPI值最低，PA新生儿血TFPI最高，脐血介于两者之间，PA母血与新生儿血之间差异显著，P＜0.05。PA组母亲、脐血及新生儿血TFPI／TF均较正常分娩者显著降低，P＜0.01。2、从正常对照组和胎盘早剥病理实验组胎儿的脐静脉成功地培养出HUVECs，培养24小时，细胞贴壁生长，随后在培养液中加入表皮生长因子，可以在48-72小时内得到生长旺盛的HUVECs，细胞能够在短时间不断传代，最长可以传代5代，两组细胞在形态学上没有显著差异。进行细胞形态学鉴定：早期细胞呈小多角、球形、呈团状，2～3天后细胞为扁平多角形，相互嵌合，单层呈铺路石状排列，边界清楚，胞浆丰富，核清晰，呈圆形或椭圆形，核分裂相多见，1～2核仁，内含小颗粒，3～4d后融合，7～10d胞体呈多角形，相互嵌合。应用免疫荧光方法进行Ⅷ因子相关抗原鉴定，确认为HUVECs。应用传代的第2～3代，满足实验需要。3、质粒感受态扩增后，提取得到的质粒DNA经过测序结果显示pENTRTM／U6-TF-shRNA为阳性克隆；RT-PCR结果提示pENTRTM／U6-TF-shRNA转染后的HUVECs其TF mRNA表达水平显著降低，免疫荧光检测TF蛋白明显减少。4、将测序结果正确的pENTRTM／U6-TF-shRNA分别转染到实验对象：正常组和病理组；两组细胞在转染后形态学上没有明显差异，RT-PCR结果采用Gel-Pro Analyzer软件进行区带灰度值扫描并分析，TF相对表达强度正常组和病理组组别之间TF mRNA的表达差异显著（F=23.436，P＜0.001），RNAi干扰处理后正常组和病理组TF mRNA表达的差异显著（F=33.630，P＜0.001）；正常组和病理组未干扰（干扰前）的TF mRNA表达水平的差异显著（t=0.023），正常组和病理组假干扰（阴性对照）的TF mRNA表达水平的显著差异（t=0.010），正常组和病理组干扰（实验组）的TF mRNA表达水平的没有显著差异（t=0.516）；病理组内处理间差异显著（F=19.299，P=0.002），正常组内处理间差异显著（F=27.657，P=0.001）结论1、PA产妇、脐血及新生儿血中TF较正常者升高，TFPI降低，TFPI／TF降低，PA时产妇和新生儿促凝血功能增强，抗凝血活性降低，与其高凝状态相关。2、从正常对照组和胎盘早剥实验组胎儿的脐静脉能够大量成功地培养出HUVECs，通过形态学和免疫荧光检测证实为HUVECs，为实验提供良好的研究工具。3、成功构建的pENTRTM／U6-TF-shRNA测序结果正确，并能够转染到HUVECs，发挥其生物学功能，干扰TF的表达。4、在胎盘早剥组的HUVECs中TF mRNA表达高于正常对照组，可能是胎盘早剥产妇及新生儿高凝状态的原因之一。5、pENTRTM／U6-TF-shRNA能够显著抑制正常分娩和胎盘早剥产妇胎儿脐带的HUVECs中TF的表达，可能成为未来生物学治疗的新的手段。主要创新点：1、首次在国内研究PA时TF及TFPI在母亲、脐血及新生儿血中的变化。2、应用pENTRTM／U6载体系统构建pENTRTM／U6-TF-shRNA载体，并在HUVECs中发挥生物学作用。3、利用RNAi技术沉默胎盘早剥产妇所生新生儿的HUVECs中TF基因，实现瞬时沉默，降低了TF的表达，为进一步应用TF沉默的体内试验研究进行了有益的探索。