鼠李糖脂构建逆胶束中木质纤维素酶特性分析及其纯化研究

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木质纤维素是世界上分布最广的一种有机化合物,因为它的降解效率很低,所以成为全球碳循环过程的一个限制因素。木质纤维素酶的生产和纯化过程也十分缓慢并且产量不高,对于木质纤维素这种逐年增加的“废弃能源”来说,情况不容乐观,逆胶束萃取法被证明是对于酶的萃取纯化非常有效的方法之一。而逆胶束是通过表面活性剂的极性端和非极性端把水相和有机相结合起来的乳化结构。由表面活性剂包裹起来的水核能够增溶水溶性酶和其他的极性物质,这使得逆胶束萃取法成为了一种相对完美的液液生物萃取方法。而且,逆胶束的水核是在纳米级别的尺寸,使得增溶进入水核的酶能够保持较高和稳定的活性,对于酶萃取来说是个良性优越的环境。一般来说,逆胶束萃取主要包括两个步骤,前萃和后萃,目前大多数的学者更多的关注前萃过程,因为后萃过程的进行相对来说较难,但是后萃过程也至关重要,因为这直接关系到最终产品的质量。目前,大量的国内和国际的研究学者都在进行逆胶束萃取的研究,但是大多用的是化学表面活性剂来构建逆胶束体系。这种表面活性剂的来源相对有限,需要繁杂的工业生产,并且会给环境带来大量的化工垃圾,而且有时候他们能够使体系中的酶失活,降低酶萃取的效率。相对来说,目前越来越多人开始关注生物表面活性剂,因为它本身的可降解性和低毒性,同时能够实现体系物质的重复利用,而且由生物表面活性剂构建的逆胶束体系相对于化学表面活性剂来说,具有更好的增溶特性,不错的环境相容性和相对温和的反应环境。目前,针对生物表面活性剂的研究都进展的非常顺利,尤其是广泛使用的鼠李糖脂。在第一部分的研究中,对比三种化学表面活性剂(CTAB,AOT and Tween-80),研究了在正己醇/异辛烷(1:1,v/v)溶剂中,由鼠李糖脂构建的逆胶束中水核的性质还有其微环境的行为状况。在这一部分的研究过程中,我们构建了表面活性剂/正己醇/异辛烷/水逆胶束体系的三相图,来了解在不同表面活性剂,不同组分比例情况下,体系中三种相之间的区域大小变化。同时利用红外光谱仪在波段3050–3750 cm!1区域测了-OH基的红外振动情况,通过对于红外光谱的分析来了解逆胶束水核中水的分布状态,结合水和自由水的组成与水核大小的关系等等。而且也通过荧光法,测量了鼠李糖脂在逆胶束体系中的临界胶束浓度为0.055mm"l-1,表明即使很少剂量的鼠李糖脂也能形成逆胶束。另外,本实验还测了逆胶束体系的电导特性,可以看出体系的含水率在35.1处,电导发生了突变,这个数值比其他的化学表面活性剂的高,说明系统能够增溶更多的水。最后,还检测了逆胶束水核的尺寸,我们发现鼠李糖脂能够大量的提高逆胶束的增溶水能力,形成较大的胶束水核,从而为酶促反应提供较好的微环境。第二部分的研究,检测了以愈创木酚为底物的漆酶在逆胶束体系中的酶活变化,主要通过紫外可见分光光度法来测得漆酶酶活。含水率对于酶活的影响主要呈现一个钟鼎状,先增大后减小,在!0=19处取得酶活的最大。当水相的ph=5.2,[kcl]=0.05mol"l-1,鼠李糖脂逆胶束体系漆酶活性能够达到最优状态。另外,我们考察了不同介质对于漆酶降解的动力过程的影响,在逆胶束中酶活没有在水介质中高,但是在逆胶束体系中,鼠李糖脂逆胶束相对于其他化学表面活性剂依然有着较高的漆酶酶活,在鼠李糖脂浓度为0.055mm/l取得酶活最大值。在鼠李糖脂逆胶束体系中对于纤维素酶和lip酶进行前萃过程的萃取,考察了体系中的萃取时间,ph,表面活性剂浓度和离子强度、种类对于萃取效果的影响,纤维素酶和lip酶分别有各自萃取的优化条件。lip:[rl]=50cmc,[kcl]=40mmol/l,ph值为3.0,振荡时间为30min,在kcl中有最高萃取效率;纤维素酶:[rl]=40cmc,[kcl]=50mmol/l,ph值为3.5,振荡时间为30min,在nacl中有最高萃取效率。在后萃过程中,接着前萃过程产生的萃余油相继续将溶解在其中的酶分离出来到水相当中,同样地,考察了萃取时间,ph,离子强度和种类以及外加溶剂对于后萃萃取效果的影响,在该后萃中两种酶分别有各自后萃的相对最优状况。lip:[kcl]=0.5mol/l,ph值为7.0,振荡时间为30min,乙醇体积比为8%,在kcl中有最高萃取效率;纤维素酶:[kcl]=0.15mol/l,ph值为7.0,振荡时间为40min,乙醇体系比为4%,在nacl中有最高萃取效率。通过后萃过程的研究发现,外加醇类可以明显的提高系统的酶活回收率,萃取率和纯化倍数,并且能够使得萃取过程更快更好。总的来说,对于鼠李糖脂构建的逆胶束体系来说,它能够为酶促反应和酶的液液纯化萃取(包括前萃和后萃)提高较好地条件和适宜的微环境。在正己醇/异辛烷(1:1,v/v)这个有机溶剂中,测量了由鼠李糖脂构建的逆胶束体系在各个因素下的最优状况,这对于体系维持较好的性能和将来推广该方法到工业生产中提供了大量的参数依据。然后,如果希望把这个应用推广到工业市场的话,还需要大量的工作去做。
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