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研究目的:化学恐怖袭击、次生化学灾害、以及突发化学品泄漏等多重化学威胁影响人民健康和社会安全稳定,而现有药物无法满足对抗多重化学威胁医学救治的需求。寻找多种化学中毒共性机制,筛选一组或几组药物组合是对抗多种化学威胁救治新策略。课题组前期工作发现,NLRP3炎性小体通路可能与多种化学毒剂所致中枢损伤有一定相关性。本论文旨在揭示NLRP3炎性小体通路在丙烯酰胺所致中枢损伤中的作用机制,在此基础上筛选靶向性治疗药物,为进一步证实NLRP3炎性小体作为化学毒剂致中枢损伤共性靶点提供理论依据,为化学中毒共性救治措施提供新策略。研究方法:1、建立丙烯酰胺染毒BV2细胞的体外模型,采用MTT法和LDH法观察丙烯酰胺对BV2细胞毒性的影响。采用Western blot技术检测丙烯酰胺引起的BV2细胞中NLRP3炎性小体通路蛋白的表达变化。通过药理学(NLRP3特异性拮抗剂MCC950干预)和遗传学(si RNA靶向干预NLRP3基因)阻断/沉默NLRP3基因,观察丙烯酰胺所致细胞毒性以及NLRP3炎性小体通路相关蛋白表达的变化。2、建立丙烯酰胺致小鼠中枢损伤模型,系统观察丙烯酰胺染毒引起的体重、行为学、病理损伤、浦肯野细胞以及细胞凋亡的变化。采用Western blot法检测丙烯酰胺染毒小鼠小脑组织中NLRP3炎性小体复合物(NLRP3/ASC/pro-caspase-1)及下游炎症因子(pro-IL-1β/IL-1β/IL-18)蛋白表达变化。3、分别用药理学(NLRP3特异性拮抗剂MCC950抑制)和遗传学(NLRP3基因敲除)阻断/敲除NLRP3基因,并观察对丙烯酰胺所致小鼠体重、行为学、病理损伤、浦肯野细胞以及细胞凋亡的影响。采用Western blot法分别检测小鼠小脑组织中NLRP3炎性小体复合物(NLRP3/ASC/pro-caspase-1)及下游炎症因子(pro-IL-1β/IL-1β/IL-18)蛋白表达变化,并进一步研究NLRP3敲除后对Nrf2抗氧化通路(Nrf2/Keap1/HO1/NQO1)以及氧化应激(脂质过氧化物LPO和超氧化物歧化酶SOD)的影响。在此基础上,初步探讨上市NLRP3靶向治疗药物格列本脲对丙烯酰胺中毒小鼠的神经保护作用。研究结果:1、不同浓度(0、0.5、1.25、2.5、5、10m M)丙烯酰胺染毒BV2细胞,其细胞毒性呈剂量依赖性增加。暴露于丙烯酰胺(2.5m M)的BV2细胞中NLRP3炎性小体复合物(NLRP3/ASC/pro-caspase-1)及其介导的下游炎症因子(pro-IL-1β/IL-1β/IL-18)蛋白表达显著增加。采用NLRP3特异性拮抗剂MCC950、以及si RNA NLRP3干预,可通过抑制丙烯酰胺诱导的NLRP3炎性小体复合物及其下游炎性因子表达增加,从而对丙烯酰胺引起的细胞毒性具有显著保护作用。2、丙烯酰胺(50mg/kg/d)染毒小鼠在第3天出现明显的体重减轻,第7天出现步态不稳、肌无力等共济失调症状,第10天小鼠小脑浦肯野细胞大量丢失、凋亡。此外,丙烯酰胺染毒第10天可引起小鼠小脑组织中NLRP3炎性小体复合物(NLRP3/ASC/pro-caspase-1)及其下游炎性因子(pro-IL-1β/IL-1β/IL-18)蛋白表达显著增加。3、采用NLRP3特异性拮抗剂MCC950、以及NLRP3敲除小鼠,均可通过显著抑制由丙烯酰胺引发的NLRP3炎性小体复合物(NLRP3/ASC/pro-caspase-1)及其下游炎性因子(pro-IL-1β/IL-1β/IL-18)表达的显著增加,从而对丙烯酰胺所致中枢炎性损伤具有显著神经保护作用。进一步研究发现,NLRP3基因敲除后可以上调Nrf2抗氧化信号通路(Nrf2/Keap1/HO1/NQO1),并降低LPO的产生,提高SOD的活性,发挥神经保护作用。此外,上市NLRP3靶点治疗药物格列本脲干预可显著改善丙烯酰胺所致小鼠小脑浦肯野神经元变性,减轻共济失调,具有显著治疗效果。研究结论:体内、外研究揭示了NLRP3炎性小体激活在丙烯酰胺所致中枢炎性损伤、氧化应激损伤机制中发挥双重调控作用。丙烯酰胺中毒后可诱发NLRP3炎性小体的激活,进而介导下游炎症的发生,参与浦肯野细胞的变性、减少,共济失调及神经炎症损伤;靶向阻断/敲除NLRP3基因后,可显著改善丙烯酰胺引起的体重减轻、病理损伤、共济失调以及神经炎性等中毒症状,并且可激活Nrf2抗氧化通路,减轻氧化应激损伤。提示NLRP3拮抗剂可有效防治丙烯酰胺诱导的炎症损伤及氧化应激损伤,这为丙烯酰胺中毒救治新策略提供了科学依据,也为将NLRP3作为化学毒剂致伤潜在的共性靶点,开发广谱性化学中毒对抗药物奠定理论基础。