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背景心肌缺血后及时进行血流再灌是减少急性心梗(acute myocardial infarction,AMI)所致心肌组织损伤的最有效策略。然而,缺血一定时间后重新恢复血流供应不可避免会导致心肌二次受损,即缺血-再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。免疫炎症过度激活是促进心肌I/R损伤发生发展的主要因素之一,中性粒细胞、单核/巨噬细胞等炎症细胞在其中发挥了重要作用。已有研究表明,ECSIT作为TLRs/IL-1R介导的信号通路中的关键信号分子可调控下游NF-κB结合活性、促进炎症相关基因表达。本课题组的前期研究发现,定位于线粒体内的ECSIT能够与NDUFAF1相互作用,参与调控线粒体呼吸链复合物I的组装,有效缓解心肌I/R引起的线粒体活性氧过度产生和线粒体形态功能紊乱,从而改善心肌I/R损伤。然而,ECSIT是否可在心肌I/R早期参与免疫炎症反应的调控,其机制是否与ECSIT在心肌细胞中的定位及其泛素化修饰相关尚不清楚,本文对此进行深入研究。目的明确心肌细胞内ECSIT是否对心肌I/R早期及H/R刺激诱导下的心肌细胞损伤和免疫炎症应答具有调控作用,并着重阐明ECSIT的线粒体定位及其泛素化修饰在心肌I/R损伤中发挥调控作用的具体机制。方法1.在体动物实验通过结扎冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)45 min后解开结扎线再灌注24 h复制小鼠心肌I/R损伤模型。为明确ECSIT与心肌I/R早期损伤的相关性,取周龄、体重相同的雄性成年C57BL/6小鼠随机进行I/R手术和假手术,24 h后检测小鼠心脏梗死面积和心脏功能,并观察心肌组织中ECSIT蛋白的表达和泛素化修饰情况。为进一步明确定位于线粒体的ECSIT在心肌I/R损伤早期免疫炎症应答的作用,构建并繁殖线粒体靶向过表达ECSIT转基因小鼠(Tg-Otcl ECSIT)进行相关研究。选取周龄、体重相同的雄性成年野生型小鼠和转基因小鼠,随机分为四组:野生型小鼠假手术组(WT sham)、野生型小鼠心肌I/R手术组(WTI/R)、转基因小鼠假手术组(Tgsham)和转基因小鼠心肌I/R手术组(TgI/R)。为明确ECSIT泛素化修饰在心肌I/R早期损伤的作用,选取同周龄、同体重的雄性成年C57BL/6小鼠在心肌左室前壁分点注射转染腺病毒包装的泛素化位点突变ECSIT(将ECSIT泛素化修饰所必需的372位点赖氨酸突变为丙氨酸)使其心肌过表达的ECSIT不能发生泛素化修饰,并等剂量注射对照腺病毒,一周后随机进行假手术或I/R手术。实验分成四组,包括:假手术组(sham)、心肌I/R组(I/R)、心肌I/R+GFP腺病毒对照组(I/R+Adv-GFP)以及心肌I/R+突变型ECSIT腺病毒组(I/R+Adv-K372AECSIT),主要观察心肌局部过表达泛素化修饰障碍的突变体ECSIT对心肌I/R损伤后心脏结构与功能、炎症过度激活的影响,并对其机制进行探究。2.体外细胞实验心肌I/R早期损伤的心肌细胞会诱导心肌组织炎症细胞过度浸润,加重心肌损伤。因此本课题采用出生1-3 d的新生大鼠提取并培养原代心肌细胞,以无糖培养基加1%氧气浓度条件培养1 h后给予常规培养基加常氧条件培养4 h,建立心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤模型。为进一步明确ECSIT线粒体内定位及其泛素化修饰在心肌细胞H/R损伤中的作用及机制,心肌细胞分别转染腺病毒Adv-Otc1 ECSIT、Adv-K372A ECSIT及其对照Adv-GFP,48 h之后给予H/R刺激。实验主要分为:对照组(control)、单纯H/R组(H/R)、H/R+GFP腺病毒对照组(H/R+Adv-GFP)、H/R+过表达线粒体靶向定位型ECSIT腺病毒组(H/R+Adv-Otcl ECSIT)和H/R+过表达泛素位点突变型ECSIT腺病毒组(H/R+Adv-K372A ECSIT),探讨ECSIT线粒体定位及其泛素化修饰对心肌细胞H/R损伤后细胞功能、免疫炎症的影响及其机制。3.检测指标采用Evans Blue-TTC染色、称重计量评估心肌梗死面积,采用超声心动图检测心脏功能;通过蛋白质免疫共沉淀检测ECSIT泛素化修饰水平;通过HE染色检测心肌组织炎细胞浸润;通过MPO活性检测评估中性粒细胞浸润程度;通过F4/80染色检测巨噬细胞数量;通过TUNEL染色评估凋亡细胞数量;通过EMSA(eletrophoretic mobility shift assay,电泳迁移率转变实验)检测 NF-κB 结合活性;采用Westerm Blot实验检测TLRs介导的信号通路中关键蛋白的磷酸化激活情况;通过细胞免疫荧光实验检测外源性ECSIT、NF-κB的细胞内定位变化情况;采用细胞迁移实验来反映心肌细胞诱导巨噬细胞迁移的能力。结果(一)增加线粒体内ECSIT表达或抑制ECSIT泛素化修饰可改善心肌缺血-再灌注早期损伤1.心肌缺血45 min后再灌注24 h,Evans Blue-TTC染色显示心肌I/R损伤后有明显的白色梗死灶,而且反映心功能的指标EF%(射血分数)和FS%(缩短分数)均显著下降。细胞中ECSIT总蛋白表达没有显著变化,但其泛素化修饰明显增加。2.线粒体靶向过表达ECSIT转基因小鼠在心肌缺血45 min灌注24 h后,心脏射血分数、缩短分数较野生型小鼠有明显改善,梗死灶面积也显著减小。3.小鼠心肌局部转染泛素化位点突变型ECSIT一周后实施心肌I/R手术,与转染对照腺病毒组相比,梗死面积明显减小,射血分数、缩短分数明显增加。4.心肌缺血45 min后再灌注24 h后,与各自对照组相比,转基因小鼠和局部转染突变型ECSIT小鼠的心肌组织细胞凋亡数量显著减少。5.心肌缺血45 min后再灌注24 h后,与各自对照组相比,转基因小鼠和局部转染突变型ECSIT小鼠的心肌组织HE染色显示炎性细胞浸润数量显著减少,中性粒细胞特有的MPO活性显著降低,巨噬细胞标记物F4/80荧光数量显著减少。(二)增加线粒体内ECSIT表达或抑制ECSIT泛素化修饰可改善H/R刺激诱导的心肌细胞损伤并抑制巨噬细胞迁移1.构建并转染Adv-Otcl ECSIT、Adv-K372A ECSIT于体外原代心肌细胞,转染的外源性ECSIT主要定位于心肌细胞线粒体,且能有效减少H/R刺激引起的心肌细胞ECSIT泛素化修饰的改变。2.TUNEL 染色显示,与对照组相比,转染 Adv-Otcl ECSIT、Adv-K372A ECSIT能显著减少H/R刺激引起的心肌细胞凋亡。3.Transwell 实验显示与对照组相比,转染 Adv-Otcl ECSIT、Adv-K372A ECSIT能显著减弱H/R刺激引起的心肌细胞诱导巨噬细胞迁移能力。(三)ECSIT线粒体定位及其泛素化修饰调控心肌细胞H/R损伤的分子机制1.转染 Adv-Otcl ECSIT、Adv-K372A ECSIT 的心肌细胞给予 H/R 刺激后,ECSIT仍主要定位于线粒体内。2.心肌细胞H/R刺激后TLRs信号通路中重要信号蛋白IκB、P38、ERK的磷酸化水平显著增加,而转染Adv-Otcl ECSIT、Adv-K372A ECSIT可显著减少上述蛋白的磷酸化激活。3.心肌细胞H/R刺激后NF-κB核转位增加,DNA结合活性提高,而转染Adv-Otcl ECSIT、Adv-K372AECSIT可显著减少NF-κB核转位,降低其DNA结合活性。结论在心肌I/R早期心肌细胞内ECSIT可参与TLRs介导的NF-κB信号通路的激活,并可促进炎细胞浸润,加重心肌组织细胞损伤和凋亡;而通过靶向增加线粒体内ECSIT蛋白表达或突变泛素位点抑制ECSIT泛素化修饰能够改善心肌I/R损伤。本论文研究结果有助于阐释心肌I/R早期损伤的分子机制,为临床防治心肌缺血-再灌注损伤提供有效生物学靶点。