论文部分内容阅读
快速、简便、现场化的分子鉴别方法一直是中药分子鉴别的追求。金银花为临床常用大宗中药材，在中药方剂及中成药中具有广泛应用。2010版《中国药典》规定金银花的唯一植物基原为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)。然而，之前各版《中国药典》根据临床疗效、地区用药习惯等，曾先后选定忍冬、红腺忍冬、华南忍冬、水忍冬等作为金银花正品来源，由于形态学高度相似，民间混用情况非常普遍。同时因金银花与同属伪品尤其是山银花品种形态学及化学成分高度相似，使用传统方法难以到达鉴别目的。因此急需建立快速准确的金银花分子鉴别方法。
虽然之前的研究者使用了ISSR、PCR-RFLP、DNA条形码等技术从分子水平上鉴别金银花及其伪品，但这些方法均达不到快速、鉴别鉴别的目的。也难以对金银花混伪品及含金银花中成药进行鉴别。
本研究建立了4种金银花鉴别方法，探索了金银花快速鉴别技术、现场技术及金银花混杂品与含金银花中成药的鉴别，建立了快速、简便的金银花分子鉴别方法。本论文主要包括以下5个方面的内容:
一、金银花分子鉴别方法的建立和及应用。
1、金银花EST-SSR分子鉴别方法的建立。
本研究通过生物信息学手段对本实验室保存的忍冬及其变种红白忍冬EST序列进行分析，共获得3705条忍冬EST-SSRs及2818条红白忍冬EST-SSRs。通过同源比对，在忍冬及其变种中共筛选出87对重复次数具有差异的EST-SSR。选出15对碱基数差异大于6的EST-SSR进行验证，选出了jp.ssr4、jp.ssr64及jp.ssr65等3对引物用于忍冬及其变种、山银花原植物的鉴别。
2、金银花PCR-RFLP分子鉴别方法的建立。
通过序列比对分析，发现金银花PsbA-TrnH序列190存在一个G/T变异位点，致使金银花能被内切酶HinfⅠ(G(^)ANTC)酶切而其伪品不能;金银花TrnL-TrnF序列625存在一个C/A变异位点，致使金银花能被内切酶NlaⅣ(GGNN(^)CC)酶切而其伪品不能。分别使用PsbA-TrnH通用引物及TrnL-TrnF对96份金银花样品及69份伪品样品进行PCR扩增，使用HinfⅠ及NlaⅣ进行限制性内切酶消化成功鉴别了金银花及其伪品。
3、金银花位点特异性PCR鉴别方法的建立。
通过金银花TrnL-TrnF序列625 C/A变异位点设计位点特异性PCR引物，对84份金银花基原植物及其市售饮片、伪品进行双向位点特异性PCR扩增，退火温度为61℃时，正品均出现468 bp的条带，红腺忍冬、华南忍冬、灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、水忍冬、金银忍冬、郁香忍冬、新疆忍冬、繁果忍冬等9个伪品均出现324 bp的条带，单次PCR即可鉴别正品和伪品。
4、金银花环介导等温扩增鉴别方法的建立。
根据TrnL-TrnF序列625 C/A变异位点设计了环介导等温扩增(LAMP)引物组，对21份金银花类中药及50份其他种属物种进行LAMP鉴别。当设定孵育温度为63℃时，扩增完成加入SYBR GreenⅠ荧光染料时，金银花类中药均显强烈荧光而其伪品显出极弱荧光。当温度为65℃时，能鉴别金银花与其同时伪品。
通过对比选出了位点特异性PCR及环介导等温扩增用于金银花的鉴别。
使用金银花位点特异性PCR技术构建双向位点特异性PCR组(LJ1 F、LJ1 R、L J2 F、LJ2 R)对金银花掺伪品进行了鉴别。在正品中掺入5％以上伪品即可准确鉴别，此时金银花出现765 bp及468 bp的条带，伪品出现765 bp及324 bp条带，掺伪品出现3条条带。
使用金银花位点特异性PCR技术对复方鱼腥草片、羚羊感冒片、银翘解毒片等3个含金银花生药原粉的中成药进行了鉴别，使用PCR-RFLP进行验证，发现所检测的3个市售中成药中均含有金银花与山银花。对3个中成药进行克隆测序结果发现复方鱼腥草片可能含金银花及华南忍冬，羚羊感冒片可能含金银花及红腺忍冬，银翘解毒片可能含金银花、华南忍冬、灰毡毛忍冬及红腺忍冬。
使用金银花LAMP技术设计引物组DCC-F3、DCC-B3、DCC-FIP、DCC-BIP对金银花毒性伪品断肠草原植物及其水提液进行了鉴别，当加入羟基萘酚蓝染料后63℃恒温扩增1h后，断肠草显天蓝色而金银花类药材显蓝紫色。
二、中药材DNA的快速提取。
通过优选0.5 M氢氧化钠、1％ PVP和1％Triton X-100作为提取缓冲液，使用碱裂解法提取144个中药材DNA，动物药使用COⅠ、植物药使用PsbA-TrnH通用引物进行PCR扩增，其中123个中药获得了阳性扩增结果，扩增成功率为85.2％。
使用碱裂解法提取DNA用于乌梢蛇、金钱白花蛇及金银花鉴别。使用碱裂解法10 min提取DNA，用乌梢蛇鉴别引物、金钱白花鉴别蛇引物及本文建立的金银花鉴别引物进行扩增，结果与原有DNA提取方法获得的结果一致。
三、PCR增强剂在金银花鉴定中的使用分析。
分别利用CTAB法和碱裂解法提取的180个中药材DNA样品，在PCR反应体系中使用0.5％BSA与与1％ PVP组合作为PCR增强剂，研究增强剂对通用引物ITS2、PsbA-TrnH、rbcL、matK、TrnL-TrnF片段PCR成功率的影响，发现0.5％BSA与与1％ PVP组合能显著增加通用引物PCR成功率。能提高位点特异性PCR鉴别稳定性，减少假阴性结果产生。
四、金银花快速鉴别体系的建立。
使用碱裂解法提取金银花真伪品中药材，设计引物L J-RAPID-1F及LJ-RAPID-1R进行位点特异性PCR鉴别，调整PCR反应程序为87℃预变性1 min;87℃变性0s，68℃5s进行30个循环;加入荧光染料SYBR GreenⅠ紫外比色。能在26 min内完成PCR反应，整个鉴别过程费时不超过40 min。
五、金银花现场鉴别体系的建立。
通过使用碱裂解法提取DNA，配制便携的恒温加热槽、手持式电动研磨仪及紫外灯，初步构建了金银花现场鉴别体系并成功用于金银花毒性伪品断肠草的现场鉴定。完成检测所需时间为1.5 h。
结论:
通过建立金银花位点特异性PCR及环介导等温扩增技术，使用碱裂解法提取DNA，PCR增强剂增加位点特异性PCR稳定性，建立快速位点特异性PCR，本研究构建了金银花快速鉴别体系及金银花现场鉴别体系。能在40 min内完成金银花的鉴别，在1.5 h内不需要大型仪器现场鉴别金银花毒性伪品。
本研究首次尝试了对金银花掺伪品的鉴别及3种含金银花原粉的中成药的鉴别，可检测正品中5％以上的伪品掺入量。通过位点特异性PCR快速检测含金银花原粉的中成药中金银花的真伪情况，其结果与PCR-RFLP以及克隆测序结果相符。
本研究建立了中药材DNA的碱裂解提取法，能在10 min时间内获得DNA模板用于扩增，研究了PCR增强剂对CTAB提取DNA及碱裂解法提取DNA的增强作用。有助于解决中药材分子鉴别扩率低的问题。
通过金银花位点特异性PCR技术、金银花LAMP扩增技术及碱裂解法提取DNA，本研究基本解决了金银花分子鉴别中操作复杂，检测时间长的问题。建立了快速、简便、现场化的金银花分子鉴别方法。