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第一部分小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及多能性鉴定 目的:探讨小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离培养方法,鉴定BMSCs的分化潜能。 方法:采用全骨髓贴壁培养法分离4～6周龄小鼠BMSCs,通过传代培养进一步纯化扩增,倒置显微镜下观察细胞形态及生长特征。P3 BMSCs经成脂和成骨诱导,2周后行油红O和碱性磷酸酶染色,3周后行茜素红染色,进行脂肪细胞和成骨细胞鉴定。 结果:①细胞培养情况24 h内即可见少量细胞贴壁伸展,48 h后细胞呈集落样生长,原代细胞呈梭形、圆形、多角形等,7～8 d80％的细胞融合。传代后细胞呈长梭形,传代周期5~6d。②多能性鉴定 P3 BMSCs经成脂和成骨定向诱导,油红0、碱性磷酸酶和茜素红染色鉴定,证实BMSCs可分化为脂肪细胞和成骨。 结论:全骨髓贴壁法是一种较为理想的体外分离扩增BMSCs的培养体系。BMSCs具备向成骨细胞和脂肪细胞多向分化潜能,可作为骨组织工程的种子细胞。 第二部分不同浓度BMP4对骨髓间充质干细胞的增殖、分化效应 目的:探讨(bone morphogenetic protein4,BMP4)BMP4诱导骨髓间充质干细胞增殖及向生殖细胞分化的最佳浓度。 方法:全骨髓培养法获取骨髓间充质干细胞。实验组向P3 BMSCs中添加不同浓度(5,10,20,40,80ng/ml)的BMP4,以不添加BMP4的空白组作为对照,4天后,MTT法和台盼蓝染色检测细胞的增殖率和存活率,RT-qPCR检测生殖细胞早期阶段特异性调控基因(Oct4、Dazl、Fragilis、Mvh、Nobox和Stella)的表达。 结果:在BMP4浓度为5,10,20ng/ml时BMSCs存活率最高,三组间存活率无统计学差,均显著高于0,40,80ng/ml组(P<0.05),且BMP4浓度为5ng/ml及20ng/ml时,BMSC增殖率最高。Mvh、Fragilis、OCT-4、Dazl及Stella的mRNA表达水平均在20 ng/ml组达到最高,显著高于与其它组及对照组比(P<0.05);Nobox mRNA水平则在40ng/ml组最高,不同BMP4浓度组以及与对照组间两两比较均有显著性差异(P<0.05);各组Stra8和Gdf9 mRNA表达水平均较对照组降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。 结论:BMP4诱导浓度在20ng/ml时,骨髓干细胞的存活率、增殖率及生殖细胞特异性基因表达最高,为最佳诱导浓度。 第三部分诱导骨髓SSEA-1+干细胞向卵母细胞分化的初步研究 目的:探讨骨髓SSEA-1+干细胞向卵母细胞分化的潜能。 方法:采用免疫磁珠分选系统(magnetic-activated cell sorting,MACS)分选骨髓中SSEA-1干细胞,接种于丝裂霉素C处理的小鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,mEFs)饲养层上,在含1000U/ml白血病抑制因子(LIF)的培养液中将SSEA-1+干细胞传代培养至P2,撤去饲养层,在浓度为20ng/mlBMP4的培养液中进行定向诱导,并分阶段加入10%人卵泡液、0.005IU/mlFSH和0.003 IU/ml LH。镜下观察细胞的形态学变化,RT-qPCR检测不同发育阶段生殖细胞特异性基因的表达。免疫细胞化学染色检测生殖细胞特异性蛋白表达。 结果:骨髓SSEA-1+干细胞生殖细胞特异性基因表达水平较小鼠骨髓单个核细胞和SSEA-1-组显著升高(P<0.05)。小鼠骨髓SSEA-1+干细胞与mEFs共培养后呈圆形,碱性磷酸酶染色阳性,细胞处于未分化状态。SSEA-1+干细胞诱导7天形成细胞集落,细胞密度变小。继续培养4天可见类胚体(EB)样结构形成,细胞体积变大,诱导至21天可观察到卵母细胞样结构。随诱导时间的延长生殖细胞特异性基因尤其卵母细胞减数分裂基因Stra8和Gdf9表达水平明显升高。诱导14天检测到生殖细胞特异性蛋白Mvh表达。 结论:骨髓间充质干细胞体外经BMP4及细胞因子诱导可分化为类卵母细胞样细胞。