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目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是因长期过量饮酒引起的中毒性肝脏疾病。其包括轻症ALD、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化等类型。ALD的发病机制复杂,目前尚不完全清楚,内质网应激(ehdoplasmic reticulum stress,ERS)及其介导的肝细胞凋亡可能在其中发挥重要作用。
ERS指由于各种原因导致细胞内质网生理功能发生紊乱,钙稳态失衡,错误折叠或未折叠的蛋白质在内质网腔内聚集的一种亚细胞器的病理状态,它是使错误的蛋白质恢复正确构象并能够进一步加工的必需步骤。ERS是体内的一种自我保护机制,但如果ERS反应过强或持续时间过长,肝细胞所受损伤过于严重,则会启动细胞凋亡程序,最终导致肝细胞凋亡,从而加重肝脏病变。
以往的研究证实,在ALD中,高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia,Hhcy)可诱发ERS。胱硫醚β合成酶(cystathionine beta-synthase,CBS)为吡哆醛磷酸依赖性酶,主要在肝脏中合成,是同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)代谢过程中的关键酶,其活性的降低可能是导致高同型半胱氨酸血症的重要原因。葡萄糖调节蛋白-78(glucose-regulated protein,GRP78),是内质网内驻留最多的一种分子伴侣。应激状态下,GRP78大量表达,与未折叠蛋白结合,恢复蛋白质的正确构象。因此,GRP78被认为是ERS的标志性分子。ERS介导的肝细胞凋亡过程包括细胞内钙稳态失衡及一系列的酶促反应和信号转导。需钙蛋白酶2(calpain2)和caspase-12是存在于肝细胞中的半胱氨酸蛋白酶类,可能在此过程中发挥重要作用。本研究拟用酒精灌胃的方法建立大鼠酒精性肝病模型,检测血清总同型半胱氨酸(tHcy)的浓度和肝组织CBS的活性;分别用免疫组化法和RT-PCR法检测肝组织中GRP-78、calpain2、caspase-12蛋白和mRNA的表达变化;应用TUNEL染色法检测肝细胞凋亡。以探讨内质网应激及其介导的肝细胞凋亡在大鼠酒精性肝病中发挥的作用。
方法:选用雄性Wister大鼠50只,体重200±20g,正常饲养1周后随机分出10只为对照组,其余动物采用逐渐增加酒精浓度(浓度30％-60％,乙醇5-9g·kg-1·d-1)的方法进行酒精灌胃,分别于4周、8周、12周和16周末禁食12小时后随机处死动物9只、9只、8只和8只(大鼠在造模过程中死亡6只),留取血清及肝组织标本;检测血清ALT、AST、TG、TC、HDL、LDL、VLDL、tHcy等生化指标;用比色法测定肝组织匀浆CBS的活性。取部分肝组织冰冻切片行苏丹Ⅳ染色,观察肝细胞脂肪变性情况;另取肝组织制作石蜡切片,分别行苏木精.伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、天狼红染色、过碘酸希夫染色(PAS),观察肝组织普通病理改变,纤维化程度和肝组织胞浆糖原变化;分别用免疫组织化学染色及逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法,检测肝组织中GRP-78、calpain2、caspase-12蛋白和mRNA的表达情况。采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测肝细胞凋亡。
结果:
1、血清肝功能指标的变化:随着造模时间的延长,血清ALT和AST水平逐渐升高,CHE水平降低,与正常对照组比较P＜0.05或P＜0.01。
2、血清血脂指标的变化:随着造模时间的延长,血清TG、TC、LDL、VLDL的水平逐渐升高,HDL水平逐渐降低,与正常对照组比较P＜0.05或P＜0.01。
3、肝组织病理学改变:光镜下,HE染色显示对照组肝组织肝细胞索以肝小叶中央静脉为中心呈放射样排列;随着造模时间的延长,出现肝细胞肿胀,肝小叶内可见肝细胞小泡性脂肪变性、凋亡小体和坏死灶;模型16周组大鼠肝细胞弥漫性小泡性脂肪变性,窦周纤维化,汇管区纤维组织增生并有纤维间隔形成,可见多量凋亡小体和坏死灶。冰冻切片苏丹Ⅳ染色显示正常对照组大鼠肝组织无脂肪变性,随着造模时间延长,肝细胞内有红色脂滴分布,并逐渐增多,至16周大鼠肝细胞内出现大量红色脂滴。PAS染色显示对照组大鼠肝细胞胞浆中出现大量紫红色颗粒,模型16周仅见少量紫红色颗粒分布。天狼红染色显示模型4周组大鼠肝组织无明显纤维组织增生,随着造模时间延长,纤维间隔逐渐形成,模型16周组大鼠肝组织出现明显纤维间隔。
4、血清总同型半胱氨酸(tHcy)浓度的变化:随着造模时间的延长,血清tHcy的浓度逐渐升高,与正常对照组比较P＜0.01。
5、肝组织CBS活性的变化:随着造模时间的延长,肝组织匀浆CBS的活性逐渐下降,与正常对照组比较P＜0.05或P＜0.01。
6、免疫组化法检测大鼠肝组织GRP-78、calpain2、procaspase-12蛋白的表达:光镜下,正常组大鼠肝脏内表达较少的GRP-78、calpain2蛋白,随着造模时间的延长GRP-78、calpain2蛋白阳性表达逐渐增加,主要表达于肝细胞胞浆内,光镜下对照组大鼠肝组织有较多procaspase-12的表达,主要表达于肝细胞胞浆内,随着造模时间的延长阳性表达逐渐减弱。与正常对照组比较P＜0.01。
7、RT-PCR法检测GRP-78、calpain2、caspase-12 mRNA的表达量:正常组大鼠肝组织中表达GRP-78、calpain、caspase-12mRNA较少,随着造模时间的延长,GRP-78、calpain、caspase-12mRNA表达量逐渐增加,与正常对照组比较P＜0.01。
8、TUNEL染色法检测肝细胞凋亡指数:在正常对照组仅有极少量肝细胞凋亡,随着造模时间的延长,肝细胞凋亡指数呈上升趋势,与对照组相比,P＜0.01。
9、肝组织中CBS的表达量与血清tHcy水平呈负相关,相关系数为-0.632,P＜0.01。
10、血清tHcy水平与肝组织中GRP-78的相对表达量呈正相关,相关系数为0.617,P＜0.01。
11、肝细胞凋亡指数与calpain2和caspase-12mRNA表达呈正相关,相关系数分别为0.959和0.887,P值均小于0.01。
结论:
1、应用逐渐增加酒精浓度和剂量灌胃的方法可以成功制备大鼠ALD模型,该模型肝脏病变如脂肪变性、炎症反应和纤维化等可以反映临床ALD的基本病变。
2、在大鼠ALD模型中,CBS的活性降低,导致Hhcy,从而进一步诱发ERS,激活calpain2、caspase-12,最终导致肝细胞凋亡,可能为ALD发病的重要机制之一。