海洋源拮抗芽孢杆菌的筛选鉴定及其对黄瓜枯萎病的生防效果

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黄瓜枯萎病害是由尖孢镰刀菌寄生引起的一种世界范围内的毁灭性的土传病害,给黄瓜生产带来巨大损失。长期使用化学药剂会带来农药残留,污染环境,危害人畜健康,病原菌易产生耐药性,防效低等问题。利用拮抗菌防治黄瓜枯萎病害不仅对环境友好,人畜无害,而且病原菌不易产生抗药性,可取得良好的防治效果。寡营养、低温、高盐等特殊的海洋生境使得海洋微生物具有抑菌谱广、抑菌活性强、对营养要求低、生存适应能力强等特点,对于植物病害的防治具有重要意义。本文从连云港海域的样品中筛选得到了2株能显著抑制黄瓜尖孢镰刀菌的菌株Y3F、yw2,对菌株进行了生理生化、16S rDNA鉴定,生长条件优化。初步研究了菌株的抑菌机理、抑菌活性物质所属类别,为进一步对抗菌活性物质的提取纯化提供了理论依据。测定菌株Y3F对黄瓜枯萎病的防治效果,为菌株Y3F的进一步开发和应用提供依据,主要实验方法和结果如下:  (1)采用平板对峙法和菌丝生长速率抑制法筛选出对病原菌有较强抑菌效果的菌株。对筛选到的菌株进行形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析,在不同培养条件下测定菌液的吸光度OD600。筛选得到的2株强抑菌活性的菌株Y3F、yw2,其抑菌率均在70%以上。经初步鉴定菌株Y3F、yw2分别属于蜡样芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌,2株菌株都是轻度嗜盐菌,最适盐度为3%,最适温度是30℃。菌株Y3F、yw2的最适pH分别为5.0-9.0,6.0-8.0,最适合的装液量分别是10mL/250mL,25mL/250mL。菌株Y3F和yw2都属于芽孢杆菌,对黄瓜尖孢镰刀菌有较强的抑菌作用,具有进一步研究的价值。  (2)对筛选出来的拮抗菌株Y3F、yw2的拮抗机理、产拮抗物质的稳定性进行了初步探究,为更好的利用生防菌株提供理论依据。采用菌丝生长速率抑制法,对2株菌株的无菌滤液和活菌液的抑菌能力进行测试,并对抑菌能力较强的菌株的抑菌活性物质的性质进行初步研究,通过测定拮抗物质的热、酸碱以及蛋白酶K的稳定性,菌株Y3F的无菌滤液在100℃下处理30min,抑菌性能开始显著下降,121℃处理后完全丧失抑菌活性。pH为7.0-8.0处理下,能保持良好的抑菌活性,当pH为3.0-5.0时,随着pH的上升,抑菌活性增强;pH大于8.0,其抑菌活性显著降低,因此Y3F代谢活性物质具有一定的耐酸能力。经蛋白酶K处理后基本丧失抑菌活性。随着硫酸铵饱和度的增加,菌株Y3F的抑菌活性不断增强,饱和度为80%,抑菌活性最强。所以,菌株Y3F所产生的抑菌活性物质可能是蛋白类物质。  (3)为了提高菌株Y3F的抗菌活性物质的分泌量,增强对黄瓜尖孢镰刀菌的抑制效果。对菌株Y3F产抑菌活性物质的条件进行优化,制备在不同碳源、氮源、接种量、装液量、温度、盐度、pH条件下培养的菌株Y3F的无菌培养上层清夜。通过平板对峙法测定无菌培养上层清夜对黄瓜尖孢镰刀菌的抑制效果,探究菌株Y3F在不同培养条件下的生物量与产抑菌活性物质的关系。结果表明,适宜菌株Y3F产抑菌活性物质的培养条件是:以可溶性淀粉为碳源,酵母粉为氮源,0.5%的接种量,10mL/250mL的装液量,温度为30℃,1%的NaCI和pH为9.0,菌株Y3F的生物量的高低会影响其抑菌活性物质的分泌,进而影响其抗菌效果。  (4)通过催芽试验,测定了菌株Y3F对黄瓜种子萌发的影响,并采用温室盆栽试验,设计浸种处理(J)、灌根处理(G)、浸种和灌根(JG)、病原菌处理(B)和清水对照(Q)等处理,测定菌株Y3F对黄瓜枯萎病害的防治效果。盆栽试验表明,种植30天后,浸种和灌根同时处理(JG)的防治效果达到50.46%,对黄瓜枯萎病害有明显的控制效果。JG处理能显著提高黄瓜植株生物量。JG处理显著降低了黄瓜根际土的真菌和尖孢镰刀菌数量,增加根际的细菌和放线菌数量。菌株Y3F能有效防治黄瓜枯萎病害,改善根际微生物结构,具有进一步开发应用的前景。
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