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在碱性的热温泉中,存在着与蓝细菌共生的其他类光合细菌称为Filamentous anoxygenicphototrophs(FAPs),中文名为细丝状不产氧光合细菌,它们产生一种舍铜蛋白Auracyanins,它们的功能被认为是作为电子传递体,尤其是那些缺乏可溶性细胞色素作为电子传递体的物种中.到目前为止已经发现了A和B两种,它们都有一个非常类似的球状区域,但是不同N端结构域使之结合到细胞质膜上,并且可能结合到不同的位置从而表现不同的功能,Roseiflexus castenholzii是最新发现的一种FAPs,其基因组中仅仅发现有一个Auracyanin基因,然而在FAPs的模式种Chloroflexus aurantiacus中却存在两个Auracyanin:A和B。
本研究的主要内容是利用基因工程手段克隆和异源表达Roseiflexus castenholzii的Auracyanins的基因并且研究全长蛋白质和可用性部分蛋白质在结构和功能上的异同点,从而探究其N端结构域在其发挥功能中的重要性。本研究利用PCR方法从Roseiflexuscastenholzii基因组DNA中克隆到全长基因(480bp)和可溶部分蛋白编码基因(369bp),成功构建出重组表达质粒pPAL7-bcd和pPAL7-bcd2。在转化和鉴定正确重组子之后,在37℃下,以1.0mmol/L IPTG诱导生长至OD600=0.6左右的表达菌株E.coliBL21(DE3)异源表达Auracyanins蛋白,其中pPAL7-bcd是诱导表达带有标签的Auracyanin全蛋白,而pPAL7-bcd2是诱导表达Auracyanin可溶部分蛋白.重组菌E.coliBL21(pPAL7-bcd2)经过IPTG诱导之后的产量为每100mL得到0.66g。重组菌E.coliBL21(pPAL7-bcd)经过IPTG诱导之后的产量达到每100mL得0.70g。
将离心收获的重组茵超声波破碎,采用Tricine-SDS-PAGE和Western blot鉴定全蛋白组分、高速离心上清液和沉淀部分。结果显示,表达的目标蛋白大部分存在于上清液部分。然后通过亲和层析(Bio-Scale Mini Cartidge)纯化,获得了高纯度的两种目标产物。接着利用MALDI-TOF质谱鉴定了异源表达出来的Auracyanins的多肽结构。最后,经过体外重组铜离子的实验,试图将外源的铜离子结合到所有异源表达的Auracyanin上,并且采用吸收光谱和EPR光谱鉴定其结合状态。
研究结果发现来自于Roseiflexus的Auracyanin的吸收光谱类似于Chloroflexus的Auracyanin B。但是其EPR光谱却类似于Chloroflexus的Auracyanin A。这些结果显示出Roseiflexus的蓝铜蛋白Auracyanin含有部分Auracyanin A和B的特征。所有来自于FAPs的Auracyanins的氨基酸序列比对结果也反映出蛋白质结构有兼性的特征,类似Auracyanin A的氯基端特征和类似Auracyanin B的羰基端铜离子结合域特点。