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生物矿化的研究表明,珍珠质中基质蛋白对壳和珍珠的生长形成起重要作用,其中Nacrein是目前发现的重要基质蛋白之一。为了研究Nacrein蛋白对三角帆蚌珍珠生长的促进作用,本论文通过细胞培养及分子生物学技术对Nacrein蛋白对晶体成型的影响及组织表达差异进行分析,这对于阐明珍珠形成机理,提高珍珠质量有着重要意义,可推动育珠业的快速发展。
论文包括以下两部分内容:
一:三角帆蚌Nacrein蛋白分离纯化及其对珍珠晶体成型的影响
本试验采用三角帆蚌所产无核珍珠,通过水提法初步分离出的珍珠质水溶性基质蛋白,采用快速蛋白液相色谱(FPLC, Fast protein liquid chromatography)分离提纯三角帆蚌Nacrein蛋白,并采用配对实验设计(其中实验组和对照组各为6个组织培养样品),对实验组外套膜组织培养样品加入Nacrein蛋白,研究Nacrein蛋白对晶体成型的影响。
研究结果显示,经过FPLC分离出Nacrein蛋白分子量约为60kDa,组织培养中加入Nacrein蛋白的试验组结晶成棱形状,而未加Nacrein蛋白的对照组结晶成雪花状,而且在晶体形成的时间上,实验组也较之对照纽要早。该研究表明,Nacrein蛋白能加速外套膜组织分泌的钙质形成棱状结晶,从而对晶体成型产生影响。
二:三角帆蚌Nacrein基因3端克隆及其组织表达差异分析
试验选取健康1龄三角帆蚌,采集外套膜组织样提取总RNA,通过3-RACE PCR技术获取Nacrein基因3端序列,并进行生物信息学分析,利用荧光Real-time PCR,分析NacreinmRNA在外套膜外膜、腮、内脏团、斧足中表达水平的差异。
结果表明:试验所得Nacrein基因3端序列长度为850bp碱基,包含3个ORF。利用DNAMAN软件分析其与合浦珠母贝同源基因序列相似度为56%,与马氏珠母贝相似度为50%。Nacrein基因mRNA在未插核的三角帆蚌外套膜外膜表达量最高,与其他组织比较,差异显著(P<0.05)。在插核的三角帆蚌各组织的表达中,外套膜外膜上靠近珍珠生长的部位Nacrein基因mRNA表达量最高(P<0.05),鳃组织中表达降低(P<0.05),外套膜内膜组织、斧足中表达增加,与对应的为插核组织中Nacrein基因mRNA水平差异显著(P<0.05)。
本论文研究表明,Nacrein参与并调控了晶体成型、珍珠生长的过程,而三角帆的珍珠培育显著的影响了Nacrein基因在各个组织中表达。本研究为进一步研究基质蛋白对生物矿化的作用提供实验依据,对珍珠培育生产有一定指导意义。