松墨天牛携带的松材线虫分子检测技术

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本文在研究广州市松材线虫病发生规律的基础上,对松墨天牛及其蛹室携带寄生线虫的种类进行了调查,对松材线虫在松墨天牛中的分布进行了研究,并对松墨天牛携带的松材线虫进行了分子鉴定,取得主要结果如下: 1.从松墨天牛虫孔周围分离到了4种植物寄生线虫:松材线虫、红松滑刃线虫(Aphelenchoides resinosi)、斯坦纳长尾线虫(Seinura steineri)和小茎线虫(Ditylenchus Parvus);2种自由生活线虫:齿杆双胃线虫(Odorhabdiplogasterxiphocaudatus)和寄生小杆线虫(Parasitorhabditis spp.)。其中松材线虫是优势种群。斯坦纳长尾线虫和小茎线虫是马尾松上的国内新记录种。 2.调查了松墨天牛46头幼虫、16头蛹和63头成虫。结果表明,松墨天牛携带松材线虫和一种昆虫寄生线虫。松墨天牛蛹和成虫均携带松材线虫,而松墨天牛幼虫没有携带松材线虫。松墨天牛中后胸携带的松材线虫数量最多。经镜检,松墨天牛中后胸气门附近的气管携带的松材线虫最多。由此确定了取样部位,即取中后胸气门附近的气管直接用于分子检测,无需分离线虫。 3.引用胡月清设计的一对松材线虫特异性引物来区分松材线虫和松墨天牛以及相关的线虫,包括红松滑刃线虫、斯坦纳长尾线虫、小茎线虫、齿杆双胃线虫、寄生小杆线虫和一种非植物寄生线虫。经PCR检测,只有松材线虫产生403bp的特异性片段,而其他线虫无带。改进了单条松材线虫DNA提取技术,适用于单条松材线虫活虫、死虫、以及酒精保存松材线虫的检测。 4.利用单条线虫DNA提取方法,对带有单条松材线虫的1mg、2mg松墨天牛气管组织进行PCR扩增。电泳结果显示,能从松墨天牛组织中检测出单条松材线虫特异性DNA片段。 5.对于从林间诱捕的松墨天牛样品,挑取松墨天牛中后胸的气管2mg,经改进的单条线虫DNA提取技术,利用PCR体系,松墨天牛携带的松材线虫均能被正确检出。该体系亦能用于冷冻或酒精保存的松墨天牛样品。综上所述,利用分子生物学方法检测松墨天牛携带的松材线虫幼虫,准确、简便,整个检测过程只需5小时。本检测体系将松墨天牛的诱捕和分子检测技术有机结合起来,为提高利用松墨天牛监测松材线虫病的发生,尤其是对新疫点的监测打下了技术基础。
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